Выделение лабильной Multi-белковые комплексы по В естественных условиях Контролируемые Сотовая сшивания и иммуно-магнитного аффинной хроматографии

Краткое содержание

Ячейки проницаемыми сшивателя DSP [дитиобис-(сукцинимидил пропионат)] стабилизирует переходных и лабильной взаимодействия В естественных условиях, Что позволяет их изоляции использованием строгих белковый комплекс методов очистки. Здесь мы представляем технику для сшивания клетки, выращенные в культуре с последующим выделением белковых комплексов, иммунопреципитацией.

Аннотация

Динамичный характер клеточных механизмов часто построены на переходных и / или слабые ассоциации белка. Эти низкие взаимодействия близость исключает строгие методы выделения и идентификации белков сетей по всему белок. Использование химических сшивающих агентов позволяет селективной стабилизации лабильных взаимодействия, минуя биохимических ограничения для очистки. Здесь мы приводим протокол поддаются на клетки в культуре, которая использует homobifunctional сшивающий со спейсером руки 12 Å, дитиобис-(сукцинимидил proprionate) (DSP). DSP расщепляется снижение связь дисульфид присутствует в молекуле. Сшивка в сочетании с иммуноаффинной хроматографии белков интересов с магнитных гранул позволяет изолировать белковых комплексов, которые иначе не выдержат очистки. Этот протокол совместим с регулярными западных технологий пятном и она может быть расширены для идентификации белков методом масс-спектрометрии ^1.

Стефани А. Zlatic и Перл В. Райдер способствовали в равной степени к этой работе.

Протокол

1. Подготовка к Сшивание

1. Вам нужно будет пластина достаточное количество клеток, чтобы изоляция 500 мкг белка на стандартной реакции трубки. Одной трубки может быть достаточно для идентификации предполагаемого interactors белка интереса со стороны иммуноблота. В этом случае шарик связан материал может быть элюировали SDS-PAGE образца буфера (иммунопреципитации). Для анализа масс-спектрометрии, количество стандартных реакций должно быть увеличено минимум в десять раз и белковые комплексы должны быть элюировали вне конкуренции с пептида антигена признаны антитела используются (иммуноаффинной хроматографии). Такая стратегия позволит изоляции белковых комплексов без иммуноглобулина.
2. Оптимальная плотность клеток для сшивания находится между 75% и 90% слияния. В странах с высоким слияния условиях, клетки имеют тенденцию накапливаться друг на друга, что снижает доступность для клеточной проницаемой сшивателя для всех клеток.
3. Тип клеточной и экспериментальной условие должно быть наклеена на дне ячейки пластины. Мы регулярно включают элементы управления с транспортного средства.
4. Подготовка всех решений, кроме решения DSP до сшивания.
   1. Подготовить запас фосфатном буферном растворе буфера с CaCl ₂ 0,1 мМ CaCl ₂ и 1 мм (PBS / Ca / Mg) до начала эксперимента. Добавление ионов кальция и магния имеет решающее значение для адгезии клеток к культуре пластины в ходе эксперимента. Хранить при температуре 4 ° С.
   2. 50X Полное коктейль ингибиторов протеазы - 1 таблетка растворяется в 1 мл Milli-Q воды. Хранить при -20 ° C.
   3. 20% Тритон Х-100 отвешивать 10g тритон Х -100 и разбавленных в общем объеме 50 мл Milli-Q воды. Рок при 4 ° С в течение ночи и хранить при температуре 4 ° С до использования. Не хранить в течение более 1 месяца. Используйте разведения этого 20% акций подготовить лизис и IP буферов, описанных ниже.
   4. 50X DSP Тушение Решение 1М Трис до рН 7,4. Хранить при комнатной температуре.
   5. Подготовка 10x Буфер решение.
      10X Буфер:
      • 50 мл 1 М HEPES
      • 150 мл 5 М NaCl
      • 10 мл 0,5 М EGTA
      • 250 мкл 2 М MgCl ₂
      • Отрегулируйте рН до 7,4
      • Принесите конечный объем до 500 мл
      10X Буфер разбавляют до 1X буфера по мере необходимости.
      1x Буфер используется также в лизат и иммуно-магнитной осадков буферов.
      Буфер 1X
      • 10 мМ Hepes
      • 150 мМ NaCl
      • 1 мМ EGTA
      • 0,1 мМ MgCl ₂
      • рН 7,4
   6. Лизис буфера 1X буфера + 0,5% Тритон Х-100.
   7. Иммуно-магнитный осадков буфера (IP-Buffer) 1X буфера + 0,1% Тритон Х-100.

2. Подготовка Сшивание решений

1. Подготовка решения DSP непосредственно перед нанесением к клеткам. DSP высоко гидрофобными и должно быть распущено в ДМСО до разведения в PBS / Ca / Mg буфера. Растворите 40 мг DSP в 1 мл ДМСО. Это делает 100 мМ раствор DSP (молекулярный вес ЦОС 404,42 г / моль).
2. Теплый соответствующий объем PBS / Ca / Mg до 37 ° С с целью облегчения разведения DSP / ДМСО в PBS.
   Объемы необходимых для различных размеров пластин:
   6-луночный планшет 2 мл на лунку
   10 см пластины 10 мл на чашку
   15 см пластины 20 мл на чашку
3. Добавить 10 мкл ЦОС / ДМСО маточного раствора на каждый 1 мл теплой PBS / Ca / Mg. Добавить DSP / ДМСО маточный раствор по капле с повторным перемешиванием, пока все DSP не растворится. Сделать контрольный раствор из 10 мкл ДМСО добавляется каждый 1 мл PBS / Ca / Mg.
4. Поместите все PBS / Ca / Mg решения в ледяной бане не более 10 мин.

3. Подготовка Клетки для сшивания

1. Подготовка ледяной бане, которые будут соответствовать все пластины для сшивания или инкубации управления транспортным средством.
2. Возьмите пластины из 37 ° C инкубатора и разместите их сразу в ледяной бане.
3. Вымойте клетки в два раза ледяным PBS / Ca / Mg. Использование же объеме, что вы будете использовать для сшивателя инкубации (см. раздел 2.2).
4. Удалите вторую вымыть и добавить либо контроль транспортного средства или DSP сшивания буферного раствора.
5. Инкубировать на льду в течение двух часов. Вы должны проверить пластин примерно каждые двадцать минут, чтобы убедиться, что все клетки покрыты раствором. Вы можете заметить небольшое количество DSP осадок из раствора. Это нормально.

4. Инактивация Реакция DSP

1. Подготовка 1X тушение DSP решение 20 мМ Трис рН 7,4 в PBS / Ca / Mg (20 мкл 1 М Трис рН 7,4 на каждые 1 мл PBS / Ca / Mg).
2. Удалить управления транспортным средством и сшивания решений.
3. Добавить ледяной инактивации раствора и инкубировать на льду в течение 15 минут.

5. Лизиса клеток

1. Во время инкубации тушение DSP, подготовить буфер лизиса клеток на 0,5% Тритон Х-100 в буфере с полной коктейль ингибиторов протеазы. Добавьте 20 мкл 50X маточного раствора полных на каждый 1 мл буфера для лизиса.
2. После 15 минут инкубации тушение DSP, мыть клетки в два раза с PBS / Ca / Mg.
3. Добавить лизис буфера + комплект к клеткам и рок-при 4 ° С в течение 30 минут. Некоторые из них предложили объемы лизис буфера для различных размеров пластин:
   • 6-луночный планшет 0,5 мл на лунку
   • 10 см пластины 1 мл на чашку
   • 15 см пластины 1 мл на чашку
4. После лизиса, с помощью мобильного скребок для сбора клеток из пластины. Не забудьте сохранить лизатов на льду, чтобы минимизировать активность протеаз
5. Спиновые клеточных лизатов в течение 15 минут при температуре 4 ° С в настольный мини-центрифуге при максимальной скорости (15,000 мкг).
6. Внесите супернатант в новую пробирку. Откажитесь от гранул.
7. Анализ белка и продолжить иммунопреципитации.

6. Подготовка Иммуно-магнитных гранул осадков

Примечание: Этот шаг обычно начинается сразу после начала 2 часа сшивания инкубации.

1. Комбинат 30 мкл Dynal иммуномагнитный бусы, 500 мкл IP-буфера (1x буфера + 0,1% Тритон Х-100) и соответствующее количество антиген-специфические антитела к screwtop микроцентрифужных труб. Подготовка антител свободными и неспецифических антител труб для отрицательного контроля. Соответствующее количество антител, должны определяться на основе индивидуальных антигенов в отдельных экспериментов. Этикетка все IP-трубок.
2. Разрешить IP труб для инкубации в конце сравнению с аналогичным периодом конца рокер при комнатной температуре в течение двух часов. Кроме того, инкубировать IP-трубки с антителами в течение ночи при 4 ° день до сшивания.
3. После инкубации, сделать быстрый 10-секундный мини-центрифугирования собрать бусины в нижней части трубы.
4. Слайд трубы в магнитный держатель, который будет тянуть магнитных шариков от нижней части трубы. С бисером безопасно в сторону, теперь можно легко смыть несвязанного антитела.
5. Использование малого диаметра наконечника аспиратора, таких как кончик гелем погрузки, или P200 наконечник для удаления буфера инкубации и несвязанного антитела. Как только объем инкубации удаляют добавить в 1 мл IP-буфера.
6. Крышка трубки, мягко повторно приостанавливать бисера и инкубировать все IP труб при комнатной температуре в течение 5 минут с конца по сравнению с аналогичным конце вращения.
7. Повторите 5 минут мыть шаг (шаги 6,3 по 6,6) еще раз с новым миллилитр IP-буфера.
8. IP-трубки могут оставаться в последние инкубации мыть до сшитого лизат готова быть добавлены в бисер.

7. Инкубируйте Сшитые лизат с иммуно-магнитного бисер

1. После последнего мыть спину иммуно-магнитных гранул, вниз в мини-центрифуге в течение 10 секунд. Затем приступают к скольжению трубок в магнитный держатель.
2. Опять же, с помощью небольшого отверстия наконечника стремление, удалить инкубации объемом от трубки. Сразу же добавить 500 мкл сшитый Клеточный лизат (при условии, лизат на 1 мкг / мл) пробирки с иммуно-магнитных гранул. Если вы будете использовать пептид конкуренции в качестве отрицательного контроля, соответствующее количество пептида должны быть включены в этот момент. Предыдущие эксперименты должны быть выполнены, чтобы определить соответствующие условия конкуренции пептида. Кроме того, вы можете иметь свободный лизат иммуно-магнитных гранул в качестве отрицательного контроля. В этом случае, сразу же добавить 500 мкл лизата Buffer (Буфер 1x + 0,5% Тритон Х-100) + комплект для иммуно-магнитных гранул.
3. Аккуратно ресуспендирования бисером. Ресуспендировали бисером должно быть инкубировали при 4 °, в конце-по-конце вращения на 2 часа.

8. Вымойте Unbound лизат из бисера

1. После лизат имел достаточно времени инкубации, сделать быстрый 10-секундный спина в мини-центрифугу. Затем вставьте трубы в магнитный держатель. Магнитный держатель следует хранить в ледяной бане в течение оставшейся части эксперимента.
2. Использование малого диаметра наконечника аспиратора, удалить все несвязанные лизат. Сразу же после всех несвязанных лизат удаляется добавить 1 мл IP-буфера.
3. Крышка трубки и осторожно ресуспендируют бисером.
4. Как только бисер ресуспендировали повторить бусинка шаг гранулирования (8,1).
5. Снова аспирата от всех инкубационного объема и сразу же добавить 1 мл IP-буфера, а затем крышку трубки.
6. Аккуратно ресуспендирования бисером в IP-буфера. Инкубируйте ресуспендировали бисером в течение 5 минут при температуре 4 ° с конца по сравнению с аналогичным конце качалки.
7. Повторите бусинка промывки (8,4 по 8,6) еще 4 раза.

9. Денатурировать Выборка и сбор из бисера

1. После того как все иммуно-магнитных трубок осадков были вымыты, заново осадка бисером (8,1) и слайд-трубок вмагнитный держатель.
2. Белки связан с иммуно-магнитных гранул удаляются в денатурирующих условиях. Аспирируйте от последнего мыть буфера IP и удалять IP-трубки от магнитного держателя.
3. Добавить 1x гель Пример буфера для IP-трубки чуть выше шарик шарик объединить бус на дне пробирки снова. Количество образца буфера зависит от размера и гель, который будет использоваться. Возможно, вам придется слегка нажмите на дне пробирки, чтобы получить все бусины ресуспендировали в буфере Пример лари.
4. Повторите процесс денатурации (9,2 через 9,3) для каждого IP-трубки.
5. Иммуно-магнитных гранул ресуспендировали в гель буфера Пример затем нагревают при 75 ° С в течение 5 минут для завершения процесса денатурации.
6. Как только образец был денатурированного он может быть запущен на SDS-PAGE гель для западных промокательной. Пустые Иммуно-магнитных гранул может быть повторно центрифугированием и удаляется из образца с магнитным держателем.

10. Элюирование Сшитые Комплексы с антигенных пептидов (иммуноаффинной хроматографии).

1. После того как все иммуно-магнитных трубок иммунопреципитации были вымыты, заново осадка бисером (8,1) и слайд-трубок в магнитный держатель. Аспирируйте супернатант и добавить 10 мкл буфера дополнен антигенного пептида признаны антитела используются для immunoisolation белковых комплексов. Вы должны проверить концентрациях от 10-200 мкМ эффективного элюирования.
2. Инкубируйте бисером в течение 2 ч при 4 ° C.
3. Положите бисер в магнитном стенде и тщательно восстановить 10 мл элюируется материалом. Сохраните этот супернатант.
4. Быстро мыть бисером буфером и отбросить стирки. Сохранить бисером.
5. Добавить буфера гель Пример к сохраненному супернатант и бус до концентрации 1X. Инкубируйте этих труб при температуре 75 ° С в течение 5 минут.
6. Анализ бисером и пептид элюата на SDS-PAGE. Элюата должен быть свободен от IgG как белка пятна SDS-PAGE или иммуноблотов (рис. 1В). Этот материал бесплатно IgG подходит для масс-спектрометрии.

Рисунок 1. Изоляция AP-3 взаимодействующих белковых комплексов и мембранных белков. НЕК293 () или PC12 клетках (Б) лечились либо в присутствии управления транспортным средством (ДМСО, нечетные полосы Рис 1А) или ДСП (даже полосы на рис. 1A или все полос движения в 1B рис). Разъяснено экстракты инкубировали либо с бисером в одиночку (рис. 1А, Lanes 3-4), рецептор трансферрина антител (рис. 1А, Lanes 5-6), или АП-3 δ антител (рис. 1А, Lanes 7-10, рис . 1Б, дорожки 1-10). Иммунные комплексы элюировали SDS-PAGE образца буфера (рис. 1А), буфер в одиночку или (рис. 1Б, дорожки 1-2), или буфер дополнен с увеличением концентрации пептидных антигенных δ соответствующих аминокислот 680 710 от человека δ-adaptin (NCBI: AAD03777; GI: 1923266) (рис. 1Б, дорожки 3-10). Этот пептид связывает δ антител. После элюирования пептида, супернатанты (S) и бисера (б) были проанализированы иммуноблоттинга (рис. 1В). AP-3, который обнаруживается с антителами против δ, β3 и σ3 подразделения, соосаждается со следующими растворимых факторов: клатрин тяжелой цепи (ХГС), БЛОК-1 субъединицы pallidin и HOPS комплекс vps33b субъединицы; а также мембранных белков фосфатидилинозитол-4-киназа II типа альфа (PI4KIIα) и цинка транспортер 3 (ZnT3). Обратите внимание на отсутствие IgG мыши в тяжелые цепи пептида элюируют супернатант на рис. 1В.

Обсуждение

DSP, мембраны проницаемыми, химически приводимым сшивающий со спейсером руки 12 Å используется для стабилизации переходных взаимодействий белков ^1,2,3,4. Здесь примером этой стратегии с адаптером комплекса AP-3 растворимый комплекс белок, который распознает и сортирует мембранных белков в пузырьки из эндосомы ^5. АП-3 выборочно связывается с цинком транспортер ZnT3 и липидного киназы фосфатидилинозитол-4-киназа II типа альфа, но не рецептора трансферрина ^1,4,6. Мы расширили эти наблюдения...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фосфатно-солевой буферизированный	инвитроген	P4417	Растворите 1 таблетку в 200 мл воды; добавьте MgCl2 до конечной концентрации 1 мМ и CaCl2 до конечной концентрации 0,1 mM
Dithiobis (сукцинимидилпропионат) (DSP)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22585	Чувствительный к влаге, хранить в герметичном контейнере 4° C
Диметилсульфоксид (ДМСО) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
Triton X-100, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	T9284
Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG	Invitrogen	110.31	Бусины также доступны в виде овец против кроликов
Dyna-Mag-2 магнит	Invitrogen	123-21D