Ячейки проницаемыми сшивателя DSP [дитиобис-(сукцинимидил пропионат)] стабилизирует переходных и лабильной взаимодействия В естественных условиях, Что позволяет их изоляции использованием строгих белковый комплекс методов очистки. Здесь мы представляем технику для сшивания клетки, выращенные в культуре с последующим выделением белковых комплексов, иммунопреципитацией.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение лабильной Multi-белковые комплексы по В естественных условиях Контролируемые Сотовая сшивания и иммуно-магнитного аффинной хроматографии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Динамичный характер клеточных механизмов часто построены на переходных и / или слабые ассоциации белка. Эти низкие взаимодействия близость исключает строгие методы выделения и идентификации белков сетей по всему белок. Использование химических сшивающих агентов позволяет селективной стабилизации лабильных взаимодействия, минуя биохимических ограничения для очистки. Здесь мы приводим протокол поддаются на клетки в культуре, которая использует homobifunctional сшивающий со спейсером руки 12 Å, дитиобис-(сукцинимидил proprionate) (DSP). DSP расщепляется снижение связь дисульфид присутствует в молекуле. Сшивка в сочетании с иммуноаффинной хроматографии белков интересов с магнитных гранул позволяет изолировать белковых комплексов, которые иначе не выдержат очистки. Этот протокол совместим с регулярными западных технологий пятном и она может быть расширены для идентификации белков методом масс-спектрометрии 1.
Стефани А. Zlatic и Перл В. Райдер способствовали в равной степени к этой работе.
Протокол
1. Подготовка к Сшивание
- Вам нужно будет пластина достаточное количество клеток, чтобы изоляция 500 мкг белка на стандартной реакции трубки. Одной трубки может быть достаточно для идентификации предполагаемого interactors белка интереса со стороны иммуноблота. В этом случае шарик связан материал может быть элюировали SDS-PAGE образца буфера (иммунопреципитации). Для анализа масс-спектрометрии, количество стандартных реакций должно быть увеличено минимум в десять раз и белковые комплексы должны быть элюировали вне конкуренции с пептида антигена признаны антитела используются (иммуноаффинной хроматографии). Такая стратегия позволит изоляции белковых комплекс....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
DSP, мембраны проницаемыми, химически приводимым сшивающий со спейсером руки 12 Å используется для стабилизации переходных взаимодействий белков 1,2,3,4. Здесь примером этой стратегии с адаптером комплекса AP-3 растворимый комплекс белок, который распознает и сортирует мембранных белков в пузырьки из эндосомы 5. АП-3 выборочно связывается с цинком транспортер ZnT3 и липидного киназы фосфатидилинозитол-4-киназа II типа альфа, но не рецептора трансферрина 1,4,6. Мы расширили эти наблюдения.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья В. Ф. (NS42599 и GM077569).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фосфатно-солевой буферный раствор | Invitrogen | P4417 | Растворить 1 таблетку в 200 mL воды; добавить MgCl2 до конечной концентрации 1 mM и CaCl2 до конечной концентрации 0.1 mM |
| Дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22585 | Чувствителен к влаге, хранить в герметичном контейнере при 4°C |
| Диметилсульфоксид (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Dynabeads, овечьи антитела к IgG мыши | Invitrogen | 110.31 | Бусины также доступны в виде овечьих антител к кроличьим IgG |
| Магнит Dyna-Mag-2 | Invitrogen | 123-21D |
Ссылки
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
