Измерение 50% Гемолитическая Дополнение (CH 50) Активность сыворотки

Краткое содержание

Классический путь активируется антител и достигает высшей точки в целевую лизис клетки. CH ₅₀ Анализ позволяет определить дополнять активность сыворотки. Это видео демонстрирует этапы определения CH ₅₀ Из сыворотки, расчетов и интерпретация результатов.

Аннотация

Системы комплемента представляет собой группу белков, которые при активации приводит к лизису клетки-мишени и облегчает фагоцитоз через opsonisation. Отдельные компоненты дополнения могут быть количественно однако это не дает никакой информации о деятельности путем. CH

Протокол

Подготовка 5x веронал буферного раствора (VBS)

1. Для подготовки веронал буферного раствора (VBS), три отдельных решения должны быть подготовлены.
2. Подготовка раствора 1, растворяя 21.25gm из NaCl и 0.94gm натрия Barbitone в 350 мл дистиллированной воды. Конечные концентрации NaCl и натрия Barbitone являются 1.02M и 13 мм соответственно.
3. Подготовка раствора 2, растворяя 1.44gm из Barbitone в 125 мл горячей дистиллированной воды. Конечная концентрация Barbitone является 62.5mM.
4. Подготовка раствора 3, растворяя 20.33gm из MgCl ₂ и 4.41gm из CaCl ₂ в 100 мл дистиллированной воды. Конечной концентрации MgCl ₂ и CaCl _2, 2.18M и 440мм соответственно.
5. Смешайте растворы 1 и 2 и охладить до комнатной температуры.
6. После совместного решения остынет, добавить 1.25ml решения 3 и регулировать рН до 7.3-7.5 использованием 1М HCl.
7. Отрегулируйте конечного объема 500 мл дистиллированной воды для приготовления 5x маточного раствора.
8. Для подготовки 1x рабочий раствор, развести акции 1:05 дистиллированной водой.

Сенсибилизация из эритроцитов барана с гемолизин

1. Подготовка гемолизин по во-первых разбавления 1:50 с VBS
2. Для 4 мл ЭБ добавить 6 мл на VBS и осторожно перемешайте инверсии
3. Центрифуга на 600 г х 5 минут
4. Удалите супернатант и промыть клетки еще 2 раза
5. После последней промывки, центрифуги клеток в 900 г 5 минут х упаковать клетки
6. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в достаточном VBS подготовить 10% раствор, т.е. 0,5 мл упакованных клеток ресуспендируют в 5 мл буфера
7. По каплям добавить равный объем гемолизин (кролик против овец красный антитела клеток крови) для клеток, закрученной непрерывно
8. Инкубировать при температуре 30 ° С в течение 30 минут на водяной бане
9. Аккуратно перемешайте клетки каждые 15 минут
10. Sensitised ЭБ, могут храниться в течение ночи при 4 ° С

CH ₅₀ анализа

1. Этикетка ряд труб в двух экземплярах с 1:08, 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128.
2. Приготовьте серию в два раза серийных разведений контрольных и испытательных сыворотки в VBS каждый в двух экземплярах
3. Начало в 1:04 (100 мл сыворотки + 300 мл VBS) и передачу 200 мл образца в следующем помечены трубки.
4. Тщательно перемешать между разведения и передачи 200мл к следующему разбавления свежей кончика пипетки.
5. Повторяйте, пока все пять разведения делаются.
6. Отменить 200мл от окончательного 1:128 разбавления.
7. Добавить 200 мл приостановлено сенсибилизированных ЭБ во все пробирки.
8. Этикетка два отдельных труб как пустые и добавьте 200 мл сенсибилизированных ЭБ + 200 мл VBS. Эти трубки будут измерять спонтанного лизиса ЭБ в VBS.
9. Этикетка еще две отдельные трубы, ОБЩАЯ лизиса и добавить 200 мл сенсибилизированных ЭБ + 200 мл дистиллированной воды.
10. Аккуратно перемешайте все пробирки.
11. Инкубировать при 37 ° С в течение 30 минут в водяной бане смешивания через 15 минут.
12. Центрифуга образцов при 1500 г в течение 5 минут, чтобы осадок эритроцитов.
13. Передача 100 мл супернатант из каждой пробирки, чтобы хорошо в 96-плоским дном тарелку.
14. Добавить 100 мл дистиллированной воды в каждую лунку.
15. Измерить абсорбцию образцов при 540нм использованием пластины спектрофотометр.

Расчеты

1. Рассчитать среднюю оптическую плотность каждого образца
2. Вычтите BLANK абсорбции (спонтанного лизиса) из всех образцов
3. Рассчитать% лизис для каждого разведения по следующей формуле:
   
4. Участок процент лизиса (вертикальная ось) в зависимости от разведения сывороток на горизонтальной оси.
5. Расчет разбавления требуется на 50% гемолизу для контроля и испытания сыворотки (рис. 2).

Представитель Результаты:

Видео включает в себя пример представителя результаты. На практике контроль сыворотки также запустить в то же время в качестве тест-сыворотки и рассматривается в том же порядке. Ниже (табл. 1) приведен пример данных из протестированных образцов сыворотки. Данные манипуляции в соответствии с уравнением, представленные в 5,3.

Образец	OD 540	Среднее
Пустой	0,042, 0,044	0,043
Всего лизис	0,183, 0,183	0,183
	OD 540	Среднее	Средние и Бланк	% Лизис
1:08	0,200, 0,219	0,210	0,168	116
1:16	0,179, 0,173	0,176	0,134	93
1:32	0,134, 0,110	0,122	0,08	55
1:64	0,053, 0,066	0,059	0,017	12
1:128	0,044, 0,045	0,045	0,003	2

Рисунок 1. Активация классического пути комплемента. Классический путь активируется путем связывания иммуноглобулина M (IgM) или иммуноглобулин G (IgG) на поверхности клетки-мишени. Fc части Ab связывается с C1q, C1R будет активирована, и это в свою очередь, активирует другой молекулой C1R которые вместе активирует две молекулы C1s. C1s теперь расщепляет С4, который предоставляет сайт связывания С2, который также расщепляется. Связывание C4b и C2a приводит к образованию комплекса называют конвертазы С3. Этот комплекс теперь расщепляет C3 формирования C3a и C3b, некоторые из которых в сочетании с конвертазы C3 формирования конвертазы C5. Этот комплекс в настоящее время действует на С5, с результатом C5b привязки к C6 начало образованию комплекса мембранной атаки (MAC). C5b6 действует на C7, который в свою очередь воздействуют на С8 и в конечном счете на C9 в результате формирования окончательной MAC. (Goldsby и др., 2003).

Рисунок 2. Построение выборки данных и расчета CH50 для контроля и испытания образцов сыворотки. (А), рассчитанный в процентах (%) лизис и управления (•) и тест () образцах сыворотки показаны в зависимости от разбавления фактор. (Б) Для расчета 50% лизиса, линия рисуется от 50% процентов значения, до пересечения с графиком линии, а затем вертикальная линия до разбавления. В этом примере 35-кратного разбавления контроля и 21,6 раза разведения теста сыворотки, необходимой для достижения 50% лизиса. Эти данные показывают, что там меньше дополнением присутствуют в сыворотке тест по сравнению с контролем, как это требуется меньше разбавление до 50% лизиса была достигнута. Контрольная проба также показывает,> 100% лизиса в разведении 1:8. Скорее всего, это из-за неполного лизиса ЭБ на дистиллированную воду и более эффективное лизис компонентов комплемента.

Обсуждение

CH ₅₀ анализа подлежит много помех. Некоторые ЭБ более хрупки, чем другие, в результате спонтанного гемолиза, что не имеет отношения к дополнять деятельность. Сродство антител кролика варьируется от партии к партии и от одного производителя к другому, это влияет на количество антител, которые связываются с ЭБ. Кроме того, процесс информирования ЭБ с антителами приводит к клеткам с разным количеством антител покрытие ЭБ. Сбор и хранение образцов являются важным потенциальным источником ошибок. Компонентов комп...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Эритроциты овцы	CSL	2490201	Использовать в конечной концентрации 1%
Сыворотка			Сыворотка крови человека
Неконъюгированная кроличья антисыворотка к эритроцитам овцы (гемолитическая)	AbD Serotec	C12HSB
96-луночный планшет с плоским дном	Sarstedt Ltd	83.1839
Верональный буферный физраствор			Использовать в конечной концентрации 1x
Водяная баня
Планшетный ридер
Помещение/инкубатор при 37°C