Монтирование мозга взрослой дрозофилы: метод подготовки слайдов для конфокальной визуализации

Этот протокол является выдержкой из Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Крепление мозга взрослого D. melanogaster на предметные стекла микроскопа и визуализация

1. Соорудите горку-«мостик». Расположите два «базовых» покровных стекла на расстоянии примерно 1 см друг от друга на положительно заряженном предметном стекле. Убедитесь, что положительно заряженная сторона предметного стекла обращена вверх. Приклейте покровные стекла к предметному стеклу лаком для ногтей, как показано на рисунке Рисунок 1A. Как правило, полезно загерметизировать три внешних края каждого клинка основания лаком для ногтей, чтобы монтажный материал не впитывал под эти клинья нижней крышки. Дайте лаку для ногтей полностью высохнуть (10 - 15 минут) перед тем, как продолжить.
2. Поместите предметное стекло под стереомикроскоп и внесите пипеткой раствор монтажной среды, содержащий расчлененные мозги, в пространство между двумя покровными стеклами. Чтобы обеспечить больший контраст, полезно маневрировать фонарями на гусиной шее так, чтобы они были параллельны столешнице скамейки.
3. Удалите лишний монтажный материал с предметного стекла с помощью пипетки, стараясь не зацепить мозги от предметного стекла.
4. Уберите лишний монтажный носитель. Это позволит более точно расположить мозг на следующем этапе.
5. С помощью пары щипцов и стереомикроскопа расположите мозг на предметном стекле в виде сетки антенными лепестками вверх.
6. Поместите защитный лист («мост») над мозгами (рисунок 1A). Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать стороны накладки крышки моста в местах, где они соприкасаются с «базовыми» накладками.
7. С помощью пипетки p200 медленно заполните центральную полость под мостом свежим монтажным материалом (Рисунок 1B). Помещайте по одной капле на открытый край центрального покровного стекла и дайте монтажному материалу впитать жидкость под покровное стекло центрального моста. Продолжайте до тех пор, пока вся полость не будет заполнена монтажным материалом, затем заклейте верхнюю и нижнюю части прозрачным лаком для ногтей.
8. Как только лак для ногтей высохнет, немедленно сфотографируйте предметные стекла или храните в светонепроницаемой плотной коробке при температуре -20 °C.
9. В течение одной недели визуализируйте мозг с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа с возбуждающими лазерами и фильтрующими кубами, соответствующими выбранным флуоресцентным вторичным антителам. Z-стековые изображения нейронов грибовидных тел обычно получаются с использованием объективов 20X или 40X. Визуализация фоторецепторных нейронов сетчатки может потребовать большего увеличения.

Рисунок 1: Монтирование мозга при подготовке к иммунофлуоресцентной визуализации. (A) Мозги устанавливаются на слайды SuperFrost Plus с крышкой моста для предотвращения сплющивания мозга. Два «базовых» защитных стекла приклеиваются к положительно заряженному предметному стеклу Superfrost Plus с прозрачным лаком для ногтей, а затем на предметное стекло между ними помещаются препарированные мозги. Прозрачный чехол «мост» размещается над мозгами и приклеивается к нижнему покровному клинку. (B) После того, как лак для ногтей высохнет, Vectashield медленно вводится пипеткой под мост для сохранения флуоресценции вторичного антитела. Затем прозрачный лак для ногтей используется для герметизации верхней и нижней части крышки «моста». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.