$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол является выдержкой из Zhang et al, The C. elegans Gut As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017).
Окрашивание антителами кишечника C. elegans
- фиксация
- Возьмите чистое предметное стекло и используйте поли-L-лизин, чтобы создать тонкую пленку, на которую прилипнут черви. Поместите 30 мкл 0,1-0,2% поли-L-лизина на предметное стекло и поместите второе предметное стекло на каплю поли-L-лизина, чтобы получился «бутерброд». Затем слегка потрите слайды несколько раз, чтобы намочить все поверхности обеих поверхностей, и дайте им высохнуть на воздухе в течение 30 минут. Подпишите матовую сторону слайдов карандашом.
ПРИМЕЧАНИЕ: 0,2% аликвоты поли-L-лизина в 200 мкл были получены путем растворения порошка в dH2O; его можно хранить при температуре -20 °C. Используйте высокомолекулярный поли-L-лизин для улучшения склеивания червей. Концентрация поли-L-лизина также имеет решающее значение. Слишком низкие концентрации не позволят червям прилипнуть, но слишком высокие концентрации могут генерировать фоновый сигнал флуоресценции. Слишком толстая пленка может разрыхлиться целиком.
- Плотно положите плоский металлический брусок на дно контейнера (например, контейнера из полистирола), наполненного жидким азотом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо этого можно использовать сухой лед, но жидкий азот сохраняет металлический блок более устойчивым на дне контейнера и хорошо охлаждает.
- Собирайте червей, смывая их с пластин с помощью M9, или собирайте червей разных стадий (яйца, червей стадии L1, L2, L3 или L4) на каждой горке. Как правило, на каждом слайде выбирают ~100 личинок и эмбрионов или ~20 взрослых особей. Поместите 10 мкл смытых червей на середину предметного стекла или соберите яйца/червей в 10 мкл M9 или 10 мкл 1x PBS (фосфатно-солевой буфер).
- Используйте пипетку, чтобы распределить большое количество червей, чтобы избежать комков><.
Примечание: Смешанные популяции смытых червей, из-за скученности и разной толщины стадий, плохо прилипают и менее эффективно замораживаются (см. ниже), поэтому выбор червей, специфичных для стадий (или синхронизированных популяций), дает превосходные результаты. Личинки прилипают лучше, чем взрослые особи, и на одну горку можно поместить больше животных.
- Прежде чем собирать червей на предметных стеклах, перенесите их в тарелку с нематодной средой для роста (NGM) без бактерий OP50. Избыток прилипших к червям бактерий также может помешать прилипанию. Следите за тем, чтобы черви не пересыхали.
- Аккуратно поместите (уроните) покровный стекло диаметром 22 мм × 22 мм крест-накрест поверх собранных червей так, чтобы его края свисали хотя бы с одной стороны предметного стекла. Мягко, но сильно надавите одним или двумя пальцами на покровную крышку. Избегайте сдвига, который может повредить целостность тканей.
- Немедленно и аккуратно перенесите предметное стекло на металлический блок в жидкий азот и дайте ему постоять около 5 минут для замерзания. Затем «смахните» покровную крышку одним быстрым движением с помощью выступающего края.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг нужно делать решительно и пока горло застывает, добиться «растрескивания» кутикулы. Внимание: Пожалуйста, следуйте рекомендациям СИЗ (средств индивидуальной защиты) при работе с жидким азотом.
- Погрузите потрескавшиеся предметные стекла в наполненную метанолом стеклянную банку Coplin на 5 минут при температуре -20 °C. Затем переложите в наполненную ацетоном стеклянную банку Coplin еще на 5 минут при температуре -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метанол и ацетон следует хранить при температуре -20 °C не менее 30 минут перед использованием. После фиксации предметные стекла можно хранить при температуре -20 °C.<бр/>
ВНИМАНИЕ: метанол и ацетон токсичны.
- Перед использованием извлеките предметные стекла из банки и дайте им высохнуть на воздухе при комнатной температуре (RT).