Этот протокол взят из Teoh et al., Quantitative Approaches for Study Cellular Structures and Organella Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
Подготовка слайдов к визуализации
- Приготовьте 3-4% сырого агарозного бульона в бутылке, пригодной для микроволновой печи (3-4 г на 100 мл сверхчистой воды).<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Агар можно использовать вместо агарозы в той же концентрации.
- Осторожно растопите агарозу в микроволновой печи, стараясь не перекипеть, пока вся агароза не растворится (прозрачный раствор). Поддерживайте температуру раствора при температуре 70 °C, чтобы предотвратить затвердевание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Агарозный подвой можно использовать несколько раз. Разогрейте перед использованием, если агароза застыла.
- С помощью пастеровской пипетки нанесите каплю расплавленной агарозы на предметное стекло микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте попадания пузырьков воздуха в каплю агара, так как они нарушают целостность прокладки.
- Немедленно придавите каплю агарозы другим предметным стеклом микроскопа, аккуратно расплющивая агарозу в прокладку между двумя предметными стеклами.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе следует удалить остатки пузырей. Если нет, следует сделать новые горки, так как животные могут легко застрять в пузырях. Не допускайте перелива агара в сторону при нажатии на затвор.
- Оставьте агарозу сохнуть на 1 минуту.
- Осторожно разделите два предметных стекла, чтобы не повредить агарозу, при этом оставьте застывшую прокладку на одном из стекол.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды с агарозными подушечками всегда следует готовить свежими непосредственно перед экспериментом, так как они могут высохнуть. Убедитесь, что агарозная подушечка имеет одинаковую толщину. На прокладке не должно быть пузырьков воздуха или трещин, так как это может помешать визуализации.
- Добавьте небольшую каплю (5-10 μл) 0,05% тетрамизола гидрохлорида (анестетика) в центр агарозной прокладки.
- Используя термостерилизованную кирку, быстро пересадите около 10 – 15 животных из тарелки с бульоном в обезболивающую каплю до того, как раствор высохнет. Избегайте переноса слишком большого количества бактерий OP50, так как это делает раствор мутным, что может помешать визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если раствор анестетика высохнет во время сбора, просто нанесите животным вторую каплю 0,05% тетрамизола гидрохлорида. Животные, как правило, ложатся на бок в растворе анестетика.
- Нанесите покровное стекло, расположив его чуть выше агарозной подушечки и осторожно опустив вниз. Это предотвратит образование пузырей. Не давите на покровное стекло, так как это может раздавить животных.
- Подпишите слайды названием сорта.