$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол представляет собой выдержку из Tauc et al., Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior during Aging, J. Vis. Exp. (2014).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если этот протокол используется впервые для выделения ISC методом сортировки FAC, следующие элементы управления являются обязательными для первоначальной правильной установки параметров FACS: Диссоциированные клетки из дикого типа (например, w1118) Drosophila midguts без Sytox. Диссоциированные клетки дикого типа (например, w1118) Drosophila midguts с Sytox (см. Шаг 3.6). Диссоциированные клетки из средних кишек линии мух esg-Gal4, UAS-GFP без Sytox.
1. Приготовление растворов и блюд для вскрытия кишечника
- Приготовьте 4-6 флаконов в каждом, содержащий по 40 самок мух из лески esg-Gal4, UAS-GFP.
- Из 10x PBS стокового раствора приготовьте 500 мл 1x PBS (1,8 мМ2PO4·H2O, 8,4 мМ Na2HPO4·2H2O, 175 мМ NaCl, отрегулируйте pH до 7,4).
- Приготовьте 3,5% раствор агарозы в 1х ПБС (3,5 г электрофореза сорта агарозы в 100 мл 1х ПБС). Приготовьте пластины для вскрытия, налив этот раствор в чашки Петри (диаметр 8,5 см) для покрытия дна. Слой агарозы предотвращает повреждение кончиков щипцов во время процедуры рассечения. После того как гель застынет, храните дискретальные пластины при температуре 4 °C.
- Перед вскрытием приготовьте 300 мл 1x PBS + 1% BSA fresh и поместите флакон на лед или при температуре 4 °C.
- Включите центрифугу и дайте ей остыть до 4 °C.
- Обжарьте кончики 2 стеклянных пипеток Пастера, чтобы сгладить края.
- Очистите две пары щипцов и одно лезвие бритвы 70% этанолом.
- Поместите от четырех до шести микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл для сбора рассеченных средних кишек на льду.
2. Подготовка желудочно-кишечного тракта и рассечение средней кишки
- Обезболите мух из одного флакона (40 мух) сСО2 на стандартной подстилке для мух, обезглавьте всех мух с помощью бритвенного лезвия и перенесите их в тарелку для вскрытия. Налейте холодный 1x PBS/1% раствор BSA в форму для препарирования, чтобы покрыть агарозный гель. Мухи будут плавать.
- Захватите брюшную полость мухи одной парой щипцов, одновременно удерживая грудную клетку другой парой щипцов. Отделите грудную клетку от брюшной полости. Кишка будет видна, а передняя кишка/порожняк, скорее всего, все еще будет соединен с грудной клеткой.
- Возьмите кишку и вытащите ее из грудной клетки. Чтобы развернуть кишку, возьмите урожай и потяните кишку немного кпереди от брюшной полости.
- Захватите задний конец живота одной парой щипцов и край передней открытой кутикулы другой парой щипцов. Будьте осторожны, чтобы не разрушить выступающую ткань кишечника. Оттяните задний конец, чтобы сломать кутикулу, и продолжайте тянуть сзади очень осторожно, пока вся кишка не будет вытянута из брюшной полости. Урожай, возможно, придется удалить заранее, если он слишком велик, чтобы пролезть через полость тела.
- Удалите переднюю кишку, мальпигиевые канальцы, заднюю кишку и яичники, оставив обнаженную среднюю кишку.
- С помощью стеклянной пастеровской пипетки переложите партию расчлененных средних кишек в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую холодный раствор PBS/1% BSA, и держите пробирку на льду. Образцы должны быть обработаны в течение 2 часов.
- После того, как вскрытие всей партии будет завершено, промойте чашку для вскрытия водой двойной дистилляции, чтобы смыть остатки мусора. Начните препарировать следующую партию средних кишек (повторите шаги 2.1–2.7). Распарируйте как можно больше партий в течение 2 часов, затем перейдите к шагу 3.1.
3. Переваривание ткани кишечника для забора клеток для сортировки FAC
- Удалите 1x PBS/1% раствор BSA из средней кишки и добавьте 500 мкл 0,5% раствора Трипсин-ЭДТА в каждый образец.
- Хорошо проведите вихрь в течение 20 секунд и инкубируйте образцы путем осторожного покачивания/вращения со скоростью 20 об/мин при комнатной температуре в течение 25-30 минут.
- Снова сделайте вихрь примерно через 30 минут и дайте неповрежденной ткани средней кишки опуститься на дно трубки. Аккуратно удалите клетки, находящиеся во взвешенном состоянии, с помощью пипетки Пастера из пламенного стекла и отфильтруйте их через нейлоновую сетку размером 35 мкм в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Вращайте ячейки при 100 x g в течение 5 минут при 4 °C. Следует отметить, что в начале переваривания клеточная гранула может быть сначала не видна, но станет видимой по мере развития переваривания в тканях.
- Осторожно перенесите раствор трипсина обратно в исходную пробирку с образцом, содержащую оставшуюся неповрежденную ткань средней кишки. Избегайте переноса слишком большого количества клеток из гранулы.
- Осторожно повторно суспендируйте клеточную гранулу в 400 мкл холодного 1x PBS/1% BSA. Держите микроцентрифужные пробирки, содержащие диссоциированные клетки, на льду и накройте пробирки алюминиевой фольгой, чтобы защитить клетки от света.
- Снова смешайте раствор трипсина, содержащий оставшуюся неповрежденную ткань средней кишки, и поместите образцы на качалку еще на 30 минут при комнатной температуре.
- Повторяйте шаги с 3.3 по 3.4.3 до тех пор, пока вся ткань средней кишки не будет переварена. Объедините диссоциированные ячейки из всех микроцентрифужных пробирок в одну микроцентрифужную пробирку. Для этого может потребоваться этап центрифугирования как в 3.4, так как объем всех клеточных суспензий вместе взятых может превышать 1,5 мл. Держите клеточную суспензию на льду и защищайте клетки от света.
- Вращайте диссоциированные клетки при 100 x g в течение 5 минут при 4 °C. Осторожно удалите как можно больше надосадочной жидкости, оставив примерно 50-100 μл 1x PBS/1% раствора BSA в микроцентрифужной пробирке. Осторожно ресуспендируйте диссоциированные клетки в 800 мкл 1x PBS/1% BSA, содержащем Sytox (1:20 000).
- Переложите клеточную суспензию в пробирку Falcon с круглым дном объемом 5 мл, отфильтровав клетки через защелкивающийся колпачок клеточного фильтра (нейлоновая сетка 35 мкм). Всегда храните образцы клеток на льду и в защищенном от света месте. Теперь ячейки готовы к сортировке.
- Пипеткой внесите 600 мкл раствора РНК в каждую микроцентрифужную пробирку, в которую будут отсортированы клетки для последующего выделения РНК. Для других последующих применений клетки могут быть собраны в другом растворе, например, в стерильном PBS.