$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Следующий протокол представляет собой выдержку из Cornwell et al, Метод набора реплик: высокопроизводительный подход к количественному измерению продолжительности жизни Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).
1. Предотвращение производства потомства путем добавления 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUdR)
- Выращивайте животных до стадии L4 при 20 °C. Проверьте, развились ли синхронизированные животные до L4 примерно через 40 ч после посева (шаг 2.1.7).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время развития C. elegans будет варьироваться при разных температурах, и скорость роста мутантных животных, для которых скорость не была охарактеризована, должна быть проверена эмпирически.
- Добавьте 160 μL 50x FUdR на каждую 6-сантиметровую пластину с животными L4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно добавить FUdR на этапе L4. Для удобства сделайте 1 000 запасов FUdR, растворив 1 г FUdR в 10 мл сверхчистого H2O. Фильтруйте-стерилизуйте запас FUdR с помощью фильтра 0,2 мкм и шприца объемом 10 куб. см. Аликвота ~1 мл бульона в стерильные пробирки объемом 1,5 мл. Заморозьте и храните при температуре -20 °C.
- Осмотрите пластины на наличие самцов C. elegans. Удалите всех самцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность жизни обычно измеряется для гермафродитов, а не для самцов. Гермафродиты, которые спариваются, живут короче, чем неспаривающиеся животные, даже в присутствии FUdR. Самцы меньше и тоньше гермафродитов, и их можно легко узнать по характерному крючковатому хвосту.
- Положите коробку обратно в пакет с застежкой-молнией. Вернитесь в инкубатор при температуре 20 °C.
2. Жизнеспособность оценки
- Ежедневно оценивайте жизнеспособность, осторожно прикасаясь к голове животного платиновой проволокой или ресницей. Оцените животных, которые не могут двигаться, как мертвых и снимите их с тарелки (рисунок 1A). Запишите количество наблюдаемых погибших для каждого условия для каждой точки времени наблюдения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы снизить риск систематической ошибки при подсчете баллов, экспериментатор должен оставаться слепым к условиям эксперимента и точно так же не должен ссылаться на результаты из предыдущих временных точек во время подсчета баллов.
- Подвергните цензуре животных, которые разрываются, умирают от других очевидных дефектов развития или ползают по краю тарелки: удалите этих животных и запишите их количество в каждый наблюдаемый момент времени для учета в статистическом анализе. Кроме того, если самцы обнаружены, удалите их и запишите наблюдаемое количество.
- Повторяйте шаг 2.1 ежедневно до тех пор, пока в живых не останется ни одного животного><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если газон из кишечной палочки значительно уменьшится или на пластине начнет расти грибок, пересадите всех оставшихся животных в свежую пластину с соответствующими РНК-интерференцией и FUdR.
