Ферментативное расщепление и ручная диссоциация: метод подготовки эмбрионов C. elegans к культивированию клеток

Аннотация

Источник: Сангалетти, Р. и Бьянки, Л. Метод культивирования эмбриональных клеток C. elegans.J. Vis. Exp.(2013).

Это видео знакомит с методом выделения и стерильного культивирования эмбриональных клеток C. elegans in vitro.

Протокол

1. Диссоциация эмбриональных клеток

1. Следующие этапы процедуры проводят в стерильных условиях с помощью ламинарного вытяжного шкафа. В то время как животные одеваются на бактериальные пластины, стирки и обработка лизисным раствором, содержащим отбеливатель, должны уничтожить большинство, если не все бактерии. Таким образом, использование ламинарного колпака на данном этапе процедуры предотвращает новое загрязнение яйцеклетки взвесью.
2. Суспендируйте гранулированные яйца в 1 мл 2 мг/мл хитиназы (запас в буфере для яиц pH 6,5) и переложите их в новую стерильную коническую пробирку объемом 15 мл. Покачивайте трубку в течение 10-30 минут при комнатной температуре. Точное время инкубации изменяется в зависимости от свежести фермента и температуры в помещении и поэтому должно определяться для каждого препарата. Рекомендуется начинать наблюдение за яйцами под инвертированным клеточно-культуральным микроскопом через 10 мин инкубации. Примечание: по нашему опыту, низкий pH повышает ферментативную активность хитиназы. По этой причине мы используем яичный буфер при pH 6,5 для растворения хитиназы (рецепт, описанный выше, где pH регулируется до 6,5 с использованием NaOH).
3. Когда ~ 80% яичной скорлупы будет переварено с помощью обработки хитиназой (Рисунки 1 A-B), гранулируйте яйца центрифугированием при 900 x g (~2 500 об/мин) в течение 3 мин. Используя пипетку P1000 и стерильные наконечники, осторожно удалите надосадочную жидкость и добавьте 3 мл среды L-15.
4. Переложите яйца в тарелку диаметром 6 см и аккуратно диссоциируйте клетки с помощью стерильного шприца объемом 10 мл, оснащенного иглой 18 G. Следите за степенью диссоциации, помещая каплю суспензии в свежую пластиковую чашку Петри и рассматривая под микроскопом. Не втягивайте воздух в шприц во время этой процедуры, чтобы не повредить клетки. Продолжайте диссоциацию до тех пор, пока не будет диссоциировано ~80% клеток.
5. Отфильтруйте суспензию с помощью стерильного 5 мкм фильтра Millipore. Клеточные суспензии должны быть отфильтрованы для удаления клеточных комков, непереваренных яиц и вылупившихся личинок. Процедите через фильтр еще 4-5 мл свежей среды L-15 для восстановления всех клеток. Не прилагайте чрезмерных усилий на этапе фильтрации, чтобы не повредить фильтр и/или ячейки.

2. Культивирование клеток

1. Гранулируйте диссоциированные клетки центрифугированием при давлении 900 x g (~2500 об/мин) в течение 3 мин. С помощью пипетки P1000 и стерильных наконечников осторожно удалите всю надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулированные клетки в полной среде L-15 и планшете 1 мл/лунка. Количество добавляемого носителя зависит от числа 8P Используемые пластины, слияние червей на пластинах и тип экспериментов, которые будут проводиться на клетках. Плотность клеток можно определить с помощью гемоцитометра. Для патч-зажимной записи оптимальной является плотность покрытия ~ 230 000 ячеек^/см2.
2. Храните тарелку на 24 лунки в пластиковом контейнере Tupperware, содержащем влажные бумажные полотенца, чтобы избежать испарения питательной среды. Хранить контейнер во влажном инкубаторе при температуре 20 °C и окружающем воздухе.
3. Клетки обычно готовы к экспериментам в течение 24 часов, когда морфологическая дифференцировка и экспрессия маркеров GFP завершены. Клетки могут храниться в культуре до 2 недель, но обычно они наиболее здоровы до 7-9 дней после посева. Среду необходимо заменять один раз в день для поддержания здоровья клеток.

Результаты

Рисунок 1. Эмбрионы C. elegans до и после лечения хитиназой. (А) Фотография яиц до воздействия хитиназы. Стрелка указывает на прозрачную и неповрежденную яичную скорлупу, окружающую эмбрион. (B) Яйца обрабатываются хитиназой в течение 10 мин. Яичная скорлупа переварена и больше не видна вокруг эмбрионов. Стрелки указывают на трехкратные эмбрионы...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
РЕАГЕНТЫ
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Инвитроген	11415-064
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота	Инвитроген	16140-063
Пенициллин-стрептомицин	сигма	П4333-100МЛ
Хитиназа из Streptomyces Griseus	сигма	С6137-25ООН
Peanut Lectin	сигма	Л0881-10МГ
ОБОРУДОВАНИЕ
101-1000 μl Синие градуированные наконечники для пипеток	США Ароматизатор	1111-2821
10 мл Стерилизованная пипетка в индивидуальной упаковке	США Ароматизатор	1071-0810 (Английский)
Эргономичный пипетка переменного объема (100-1000 μл) с выталкивателем наконечника	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Перевод пластиковой пипетки стерильный	VWR International Inc.	14670-114
15 мл Коническая трубка	США Ароматизатор	1475-1611 гг
Стерильные иглы 18 калибра	Бектон, Дикинсон и Ко.	305196
Стерильные шприцы 10 мл	Бектон, Дикинсон и Ко.	305482
Пластиковые шприцевые фильтры Corning 0,20 мкм размер пор	Корнинг	431224
Acrodic 25 мм Шприцевой фильтр с мембраной versapor 5 мкм	VWR International Inc.	28144-095 (Английский
60x15 мм Чашка Петри стерильная	VWR International Inc.	82050-548
100x15 мм Чашка Петри стерильная	VWR International Inc.	82050-912
12 мм Диаметр стеклянных покровных колпачков	VWR International Inc.	48300-560
Прозрачные клеточные культуральные планшеты 24 лунки с плоским дном и крышкой	Томас научный	6902А09
Dumont #5- Тонкие щипцы	Инструменты для точной науки	11254-20
Центрифуга 5702	Эппендорф	22629883
Ламинарный капюшон
Инвертированный микроскоп с объективом x10
Инкубатор с увлажненным окружающим воздухом