$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол представляет собой выдержку из Tong et al, Электротаксис на основе микрофлюидики для количественного анализа локомоции Caenorhabditis elegans' по требованию, J. Vis. Exp. (2013).
1. Эксперимент с электротаксисом
- Поместите микроканал на предметный столик (желательно XY-подвижный) микроскопа с установленной камерой, подключенной к монитору (рисунок 1).
- Подключите блок питания или выходные провода усилителя к электродам микроканала. Простого источника питания постоянного тока достаточно, если требуется только сигнал постоянного тока, но усилитель, подключенный к функциональному генератору, позволяет также подавать импульсные сигналы постоянного и переменного тока.
- Подсоедините выходную трубку микроканала к одноразовому шприцу. Погрузите устье входной трубки в физиологический буфер М9 и осторожно втягивайте жидкость в канал, оказывая отрицательное давление внутри шприца (вручную или с помощью шприцевого насоса). Когда впускная и выпускная трубки будут заполнены M9, отсоедините шприц от трубки. Выровняйте обе трубки на одинаковой высоте, чтобы предотвратить гидростатический поток.
- Подайте постоянное напряжение на канал и убедитесь, что сопротивление (R= V/I) составляет около 0,6 МОм (для микроканала длиной 50 мм, шириной 0,3 мм и глубиной ~0,1 мм).
- Если вы удовлетворены целостностью канала, выполните описанные выше действия, чтобы загрузить черви из разбавленной суспензии в канал.
- Отсоедините шприц и гидростатически манипулируйте потоком, регулируя относительную высоту трубок. Используйте этот метод, чтобы поместить червячка в центр канала, а затем проложить обе трубки плашмя на одной и той же высоте.
- Установите источник питания на соответствующее напряжение: 4-12 В/см для животных стадии L3, 4-10 В/см для L4 и 2-4 В/см для молодых особей. Активируйте электрический сигнал и дайте червю 1 минуту предварительного воздействия, чтобы он акклиматизировался к полю. Червь должен начать движение к катоде. По прошествии минуты используйте камеру, чтобы начать запись.
- Для экспериментов с переменным и импульсным постоянным током максимальное чувствительное электрическое поле может быть выбрано сверху, а частота и коэффициент заполнения сигнала могут быть модулированы по желанию.
- Когда эксперимент будет завершен, удалите всю жидкость (и червей) из канала, промойте его dH20 и оставьте устройство на горячей плите при температуре 125 °C для высыхания.
- Извлекайте локомоторные данные из записанных видео вручную с помощью NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) или специального программного обеспечения для отслеживания червей на основе MATLAB.
