$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Следующий протокол представляет собой выдержку из Davies et al, An Assay for Measurement the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
-
Шаги, которые необходимо выполнить за день до анализа
- Соберите червей стадии L4 на свежие пластины питательной среды для нематод (NGM), засеянные газоном из OP50 E. coli, и культивируйте их при температуре 20 °C O/N. Для каждого условия анализа требуется 10 червей; выберите избыток червей, чтобы учесть потерю O/N червей.
- Анализируйте только тех животных, которые являются взрослыми в первый день; многие мутанты растут медленнее, чем дикие животные. Отрегулируйте время отбора штаммов с задержкой в развитии таким образом, чтобы все тестируемые животные были взрослыми в первый день.
- Шаги, которые необходимо выполнить в день проведения пробирного анализа
- Подготовка к анализу:
- Проводите анализы на стандартных незасеянных планшетах NGM размером 60 x 15 мм. Высушите все используемые пластины при температуре 37 °C в течение 2 часов со снятыми крышками. Для каждого экспериментального испытания используйте четыре высушенные планшеты NGM; Это будут планшеты для анализа этанола 0 мМ и 400 мМ и сопровождающие их акклиматизационные планшеты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь важно использование пластин NGM; Различия в составе пластин, в частности их осмолярность, могут сильно влиять на дозовую реакцию этанола на поведение, это связано, по крайней мере частично, с изменениями количества этанола, накопленного животными. NGM агар имеет концентрацию 160 мОсм.
- После сушки взвесьте каждую из незасеянных пластин NGM, которые будут использоваться в анализе, и обратите внимание на вес. Определите объем среды в пластинах исходя из веса пустой пластины. Чтобы приблизительно рассчитать пересчет веса агара в объем, предположим, что среда весит столько же, сколько равный объем воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наши наиболее стабильные результаты были получены при использовании сред NGM, которые были обезвожены настолько, что исходный объем в 10 мл имел объем после сушки в пределах 8,3–8,9 мл. Альтернативой 2-часовому времени сушки является сушка до тех пор, пока планшеты не достигнут этого диапазона объема, чтобы учесть различия в инкубаторах.
- Расплавьте 4 медных кольца (внутренний диаметр 1,6 см) на поверхности каждой из пластин, которые будут действовать как загоны для различных генотипов или групп обработки червей. Обхватите каждое кольцо щипцами и нагревайте в пламени (хорошо работает сильное пламя от горелки Бунзена) примерно 3 секунды. Немедленно поместите кольцо на тарелку, продолжая держать кольцо щипцами, чтобы оно не «проскочило».
- Убедитесь, что кольцо плотно прилегает к поверхности агара, слегка надавливая щипцами в нескольких точках кольца. При размещении кольца будьте внимательны, чтобы оставить место еще для трех колец.
- Вплавьте три дополнительных медных кольца в поверхность пластины, стараясь расположить их как можно ближе друг к другу, чтобы все четыре оказались в поле зрения камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошее уплотнение с помощью агара имеет важное значение для удержания червей в кольцах во время анализа. Кольца, которые скользят по пластине, вряд ли обеспечат правильное уплотнение с агаром и могут оставить шрамы на агаре, что позволяет червям закапываться и мешает визуализации червей.
- Для каждой пробной пластины подготовьте сопроводительную «акклиматизационную» пластину, которая должна быть высушена и незасеянной и не будет содержать этанола. Поместите на эти пластины четыре медных кольца.
- Пометьте нижнюю часть пластин рядом с каждым кольцом штаммом червяка, который будет использоваться в кольце, стараясь не писать в поле зрения самого кольца. Сопоставьте этикетки на пробирной пластине с прилагаемой к ней акклиматизационной пластиной.
- Рассчитайте количество 100% этанола для добавления в каждую пластину для анализа таким образом, чтобы конечная концентрация составляла 0 мМ или 400 мМ этанола (отношение массы к объему). Для каждого эксперимента (n = 1) будет одна пластина с этанолом 0 мМ и одна пластина с этанолом 400 мМ; Акклиматизационные пластины не получают этанол. Добавьте этанол, пипетируя его по поверхности тарелки. Используйте лабораторную пленку для герметизации пластины и дайте ей уравновеситься на столе в течение 2 часов.
- По прошествии 1,5 часа начните этап акклиматизации анализа, шаг 2.2.
- Проведение анализа передвижения: Пробирные пластины
- Осторожно перенесите по 10 червей каждой опытной группы в центр медного кольца на акклиматизационной пластине. Удалите всю пищу, которая видна на агаре в этом месте, аккуратно соскребая червячной киркой. Изменяйте порядок, в котором экспериментальные группы размещаются на пластинах в разных экспериментальных испытаниях, чтобы одни и те же штаммы не помещались на пластины в том же порядке во всех испытаниях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы перевести животных в тарелку с минимальным количеством пищи, потому что если пища с акклиматизационной пластины переносится на пробирную пластину, черви будут собираться вокруг пищи, и влияние препарата на передвижение будет затемнено.
- Будьте осторожны, чтобы не проломить поверхность агара киркой, так как это позволит червям зарыться в нору и нарушит пробу. Инкубируйте червей при RT в течение 30 минут.
- Убедитесь, что между инициациями каждой пластины есть соответствующий интервал. Опытный экспериментатор может переместить 40 животных, 10/ринг на 4 кольца за < 1,5 мин, но допустим любой интервал до 2 мин. Стандартный анализ предусматривает видеосъемку на 10-12 мин и 30-32 мин экспозиции как для 0 мМ, так и для 400 мМ этанола.
- Установите акклиматизационную пластину для экспозиции 0 мМ и акклиматизационную пластину для экспозиции 400 мМ с интервалом примерно 2 мин и 30 сек, чтобы обеспечить сохранение первого видеофайла до начала второго видео.
- После 30-минутного периода акклиматизации перенесите червей из акклиматизационных планшетов в пробирные пластины. Перенесите червей в пробирные планшеты (0 мМ или 400 мМ этанол) в том же порядке, в котором они были добавлены в акклиматизационную пластину, отслеживая время между завершением каждой пластины. Запечатайте пластину лабораторной пленкой, чтобы свести к минимуму потери этанола при испарении.
- Используйте черпающие движения с помощью плоской червячной кирки с тонкими краями, чтобы собрать червей на вершине сплющенной кирки. Выполняйте перенос червей с незасеянной акклиматизационной пластины на пробирную пластину без использования бактерий, которые обычно используются при переносе червей, поскольку они помогают приклеить червя к кирке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость, с которой животные переводятся на этом этапе, очень важна, потому что первые черви на пластине будут подвергаться воздействию этанола дольше, чем последние черви, добавленные на пластину, и более ранние временные точки могут демонстрировать некоторые зависящие от времени эффекты. Это основная причина вращения, при котором деформации сначала размещаются на пластине через экспериментальные реплики.
- Проведение локомоционного анализа: киносъемка
- Используйте комбинацию микроскопа и камеры, которая позволяет одновременно визуализировать все четыре кольца в поле зрения (примерно 42x42 мм2 квадрата), например, объектив микроскопа 0,5x, 0,8-кратное увеличение и камеру с ПЗС-матрицей размером 2048x2048 пикселей 7,4 мкм.
- Используйте равномерное освещение по всему полю зрения, что способствует распознаванию объектов на шаге порога интенсивности. Подсветка 3"x3" работает хорошо.
- Изобразите червей на пластине, расположенной стороной вверх (крышкой вниз), что создает контраст, который теряется при использовании подсветки по сравнению с традиционным источником света, проходящим через микроскоп.
- Подготовьте программное обеспечение для анализа изображений для покадровой съемки движущихся червей. Настройте программу на захват 12-битных изображений в оттенках серого каждые 1 секунду в виде видеоролика продолжительностью 2 минуты (120 кадров). Чтобы уменьшить размер выходного файла, сохраняя при этом достаточное разрешение изображения, используйте режим группирования 2x2 для захвата изображений размером 1024x1024 пикселей.
- Записывайте фильмы. Начните запись 120-кадрового фильма с первой пластины (0 мМ этанола) через 10 минут после того, как на эту пластину были помещены последние черви. Сохраните файл фильма.
- Запишите вторую пластину (400 мМ этанол). Повторите этот процесс для обеих пластин, начиная через 30 минут после того, как последние черви были помещены на первую пластину (0 мМ этанола), чтобы зафиксировать временные точки за 30–32 минуты для каждой экспозиции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставьте достаточно времени для сохранения файлов изображений после каждого сеанса съемки перед началом записи следующей пластины, подлежащей анализу.
- Для обеспечения будущей подготовки архивных фильмов и для того, чтобы эти фильмы могли быть открыты и проанализированы другими общедоступными программами с открытым исходным кодом, такими как ImageJ, преобразуйте копию каждого фильма в 8-битные файлы TIFF с 256 оттенками серого.
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанное здесь программное обеспечение для анализа изображений использует собственный формат файла.