Пробоподготовка для метаболомики: метод подготовки образцов клеток для профилирования метаболитов

Аннотация

Источник: Zhao, Y. C. et al., Системная биология метаболической регуляции с помощью передачи сигналов рецепторов эстрогена при раке молочной железы. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео описывает технику подготовки образцов клеток рака молочной железы для профилирования метаболитов. Клетки рака молочной железы лечатся эстрадиолом, который связывается с рецептором эстрогена альфа и вызывает изменение метаболитного состава.

Протокол

1. Подготовка образцов метаболомного анализа

1. Клеточное культивирование и лечение
   1. Высейте 400 000 клеток MCF7 на 10-сантиметровую пластину в питательную среду. Для каждой обработки готовят по три образца. Используйте две пластины в каждом образце, чтобы получить достаточное количество клеток для обнаружения. На 3-й день удалите среду и добавьте в клетки 5 мл свежей среды с ^10-8 М Эстрадиолом или Е2 или без него. Обрабатывайте клетки в течение 24 часов (37 °C в увлажненной атмосфере с концентрацией 5%_CO2).
2. Сбор образцов
   1. Добавьте в тарелку 5 мл ледяного 1x PBS, аспирируйте PBS, кратковременно наклонив пластину несколько раз. Повторите дважды и удалите как можно больше PBS после последней стирки.
   2. Добавьте 750 μл предварительно холодного ацетона в каждую пластину и соскребите ячейки. Соедините клетки в ацетоне из двух пластин в пробирку объемом 2 мл на льду.
   3. Количество клеток для нормализации
      1. Для каждой процедуры используйте две дополнительные пластины для количественного определения клеток. Чтобы отсоединить клетки от планшета, добавьте 2 мл буфера HE (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO₃ и 1 mM EDTA) в каждую чашку и инкубируйте в течение 5 минут.
      2. Соберите и хорошо перемешайте клетки, пипетируя клетки в буфере HE. Используйте всего 20 мкл клеточного раствора для подсчета количества клеток с помощью гемоцитометра.
3. Храните образцы при температуре -80 °C перед отправкой в центр метаболомики для идентификации и количественного определения метаболитов с помощью анализа газовой хроматографии и масс-спектрометрии (GC-MS).