Сравнительный В естественных условиях Изучение иммуногенности gp96 в Лягушка Xenopus laevis</em

Краткое содержание

Лягушка Xenopus laevis Обеспечивает привлекательную альтернативу не-млекопитающих моделью для изучения способности белка теплового шока, такие как gp96 содействовать антиген-специфических CD8 ответа Т-клеток. Мы представляем методы исследования В естественных условиях Содействие кросс-презентация кожи и опухолевых антигенов gp96.

Аннотация

Мы разработали в амфибии Xenopus laevis уникальный не-млекопитающих моделью для изучения способности определенных белков теплового шока (HSPs), таких как gp96 для облегчения кросс-презентация присмотром антигенов и вызывают врожденные и адаптивные Т-клеточные реакции. Xenopus кожи отторжения трансплантата обеспечивает отличную платформу для изучения способности gp96, чтобы выявить классической MHC класса Ia (класс Ia) ограничено Т-клеточные реакции. Кроме того, система Xenopus Модель также предлагает привлекательную альтернативу для мышей для изучения способности gp96 для генерации ответа против опухолей, которые имеют вниз регулируется их класса Ia молекул тем самым избежать иммунного надзора. В последнее время мы разработали приемных анализа передачи ячейки в Xenopus клонов использовании перитонеального лейкоцитов как антиген представляющих клеток (БТР), и показали, что gp96 может премьер CD8 Т-клеточного ответа в естественных условиях от незначительных антигенов гистосовместимости кожи, а также против опухоли тимуса Xenopus 15 / 0, что не выражает молекул класса Ia. Мы описываем здесь методология участие для выполнения этих анализов в том числе выявление, пульсирующая и приемных передачи перитонеального лейкоцитов, а также трансплантата кожи и опухоли анализы трансплантации. Кроме того, мы также описания уборки и разделения лейкоцитов периферической крови используется для проточной цитометрии и распространением тестов, которые позволяют для дальнейшего характеристика эффектора населения, участвующие в отказе кожи и противоопухолевого ответа.

Протокол

1. Животные

X. laevis х X. Джилли гибриды LG-6 и LG-15 isogenetic клонов ^1, от нашего разведения колонии в Университете Рочестера (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 и LG-15 одни и те же гетерозиготных MHC гаплотип (/ с), но отличаются в незначительных гистосовместимости (Н) локусов. Потомство от этих клонов производятся гиногенез, в котором диплоидные яйца, произведенные женщин активируются при УФ-облучении спермы (без ДНК вклад в потомство).

Использование перчаток является факультативным. Некоторые люди предпочитают не носить их, потому что это более трудно справиться лягушек (скользкой) и на самом деле это, кажется, делают лягушки неудобно.

2. Очистку gp96 от 15 / 0 Опухоль (выражает Обе опухоли и Малой H-AGS)

Gp96 очистки, описанной ранее ^{2, 3.} Короче говоря, gp96 очищают 50-70% фракционирования сульфатом аммония с последующей ConA-сефарозой и DEAE хроматографии. Около 20-50 мкг белка может быть получена на 1 мл опухолевой ткани. Чистоту препарата определяется SDS-PAGE и ленты окрашивания.

3. Выявление и сбор Перитонеальный Лейкоциты (PLS) из Малой H-Ag-разрозненных LG-6 Лягушки

1. Расти 25 мл ночь E. Coli культуры в 50 мл конической трубе при температуре 37 ° C при встряхивании.
2. Следующий день жара убивает бактерии путем кипячения его в течение 1 часа.
3. Центрифуга тепла убит Е. Коли в течение 15 мин при 2000 оборотов в минуту (1500 г) при 4 ° C.
4. Удалить супернатант и ресуспендируйте бактериальных гранул в 1 / ^10-го первоначального объема культуры (2,5 мл) в АФГ. На данный момент бактериальная культура готова к использованию и должны быть использованы в течение 24 часов.
5. Inject внутрибрюшинно (ф) 200 (для 2-дюймовый лягушки) или 300 мкл (для 3-дюймовый лягушка) из убитых нагреванием бактериального препарата на лягушку использованием 25 калибр 5 / 8 иглы.
6. Через три дня после инъекции ЯП собирают путем внутрибрюшинного промывание.
7. Перед уборкой PL, взрослые лягушки под наркозом путем погружения в 0,1% водный раствор tricaine метан сульфонат (TMS, MS-222) с буфером бикарбонат натрия в течение 5 мин, пока все движение прекращается (длительность зависит от размера и возраста). Животные просыпаться в течение 10-20 мин после лечения.
8. Лечить живота лягушки с небольшим количеством 70% этанола.
9. Inject 5 мл (для 2-дюймовый лягушки) или 10 мл (для 3-дюймовый лягушка) стерильной АФГ предварительно нагревают при комнатной температуре в брюшную полость использованием 18 калибра 1 ½ иглы. Удалите иглу и нежно массировать лягушки на минуту, чтобы убедиться, что вводится с буфером уравновешивает жидкости в полости тела.
10. Использование нового 18 калибра 1 ½ иглы без шприца для сбора жидкости брюшной полости, что будет капать из задней части иглы в чистую 50 мл коническую трубку. Убедитесь в том, чтобы получить как можно больше первоначальный объем вводят насколько это возможно. Будьте осторожны, чтобы избежать кровеносных сосудов в центральной части брюшной полости.
11. После ЯП собирают положить лягушку в контейнере с мелкой воде, пока он не проснулся в этот момент он может быть помещен обратно в свою клетку.

4. Пульсирующий и приемных Передача Lg-6 Pls Into Наивные Lg-6 Получатели

1. Вымойте ЯП раз с холодной АФГ и центрифуги их на уровне 1000 оборотов в минуту (750 г) в течение 10 мин при 4 ° C.
2. Удалить супернатант и ресуспендируйте ЯП в АФГ.
3. Импульсный ЯП с gp96 при концентрации 1 мкг gp96 на 5 х 10 ⁵ PLS.
4. Как только соответствующее количество gp96 добавляется в ЯП, смешать их pipeting и инкубировать на льду в течение 1 часа.
5. Центрифуга клетки либо при 1000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° С или при 14000 оборотов в минуту в течение 1 мин для удаления несвязанного gp96.
6. Вымойте ЯП 3X с холодной АФГ чтобы у пассажиров было никакой остаточной gp96 слева.
7. Ресуспендируют импульсного ЯП в концентрации 5 × 10 ⁵ ЯП на 300 мкл.
8. Восприимчиво передачи ЯП И. П. инъекций применяют 25 калибр 5 / 8 иглы. Inject 300 мкл импульсных ЯП (5 х 10 ⁵ клеток) на одно животное.
9. Лягушки необходимо загрунтовать минимум за 3 дня перед продолжением трансплантата кожи или опухоли экспериментов вызов.

5. Анализ кожного лоскута

Отказ кожи трансплантат устоявшихся анализа в ^{4 Xenopus, 5, 6.} В Xenopus, получатель отказывается от донорской кожи показано 1 или 2 MHC несоответствия гаплотипов в пределах 18-22 дней при температуре 21-22 ° С. В отличие от пересадки кожи между LG-6 и LG-15 клонов, которые отличаются лишь незначительными H-Ags отклоняются более медленными темпами (более 30 дней). Тем не менее, этот отказ ускоряется у реципиентов тхат быть инициирован против доноров незначительных H-Ags либо предыдущие трансплантата кожи или путем иммунизации gp96 очищают от донора. Нет отказ вообще происходит, когда донор и реципиент являются генетически идентичными (например, клонированные или полностью беспородных животных). Таким образом, эта простая техника является очень мощным для характеристики в естественных иммунных реакций, вызванных gp96.

1. Обезболить доноров лягушки, как описано в 3.7.
   Примечание: Только минимальные меры предосторожности должны быть приняты с Xenopus производить мощные антимикробные пептиды (например, magainin) в коже, устраняет необходимость в общем асептических процедур. На самом деле, лечение лягушка с любым дезинфицирующим бы вредно для кожи. Кроме того, Xenopus нет никаких патогенных микроорганизмов, которые могут быть перенесены на людей. Таким образом, использование перчаток не является обязательным. Однако все рассечение инструментов, используемых должны быть автоклавного и все решения должны быть стерильными.
2. Вырезать и удалить небольшие (20 мм х 5 мм) кусок кожи вентральной (брюшной кожи, которая появляется из-за серебристых наличие irridophore пигментных клеток) от LG-15 доноров лягушки с помощью ножниц.
3. Место кожи в Petridish содержащие АФГ и держать его на льду. Манипулирование кожной ткани очень осторожно, по возможности не держа его в между щипцами.
4. Использование бритвой или ножницами вырезать отдельные трансплантатов на 5 мм х 5 штук мм. Держите фрагментов в АФГ на льду.
5. На данный момент донор лягушки помещается в контейнер с мелкой воде, пока он не проснулся, а затем его помещают в воду, содержащую антибиотики (Penstrep при концентрации 5 мг / л). Лягушка держится в воде с антибиотиками в течение двух дней и в этот момент он возвращается в обычной воде. Небольшие раны на участке, где кожа была снята не нужно шить и заживает в течение недели.
6. Обезболить получателя LG-6 лягушку.
7. Сделайте небольшой надрез на спине (назад) кожа получателя и вставьте 5 мм х 5 мм трансплантата под кожей с серебристой стороной вверх. Будьте осторожны, чтобы не вводить большие пузыри воздуха под кожей, потому что это может привести к смещению или даже потери трансплантата.
8. Убедитесь, что вы замечаете ножницами и щипцами маркировки на трансплантаты, потому что те не считаются отторжения трансплантата раз забил начинается.
9. Через 24 часа часть кожи хост наложения должен быть удален от взяточничества.
10. Обезболить получателя LG-6 лягушку. Ручка животных, как описано в пункте 5.1.
11. Использование автоклавного ножницами вырезать окна вокруг трансплантата, так что трансплантат может быть свободно визуализируется. Будьте осторожны и не прикасайтесь донорской кожи или вызвать кровотечение. Пусть лягушки восстановить, как описано в 5.5.
12. Начало забив трансплантат сразу же, принимая эскиз. Отказ кожного лоскута определяется процент разрушения irridophores на привитых кожи.
13. Трансплантаты должны быть проверены каждые 2-3 дней, но животные не должны быть под наркозом для этого. Для визуализации трансплантаты, лягушки должны быть размещены в petridish под рассекает микроскопом.

6. Всего монтажа Immunohistology пересаженных кожи

Лягушка целом монтажа immunohistology было описано выше ^6. Короче говоря, лягушки под наркозом и помещен под микроскопом на стерильных бумажных полотенец предварительно мокрые лягушки воды (рабочая область также асептически обработке). Пересаженной кожи затем собирают вместе с небольшим количеством окружающей кожи хозяина, и это окрашивали антителами аналогично ячейке окрашивание на проточной цитометрии анализа ^6. Автоклавного инструментов и стерильных буферы должны быть использованы. После окрашивания кожи помещают на предметное стекло и слегка прижимается покровным стеклом. На данный момент кожи могут быть визуализированы использованием флуоресцентного микроскопа для различных клеточных популяций, которые проникли трансплантата. После процедуры лягушка держится в воде с помощью антибиотиков, как описано в разделе 5.5. и вернулся в обычной воде. Небольшая рана левой, где кожа была удалена заживает в течение недели.

7. Характеристика лейкоцитов крови

1. Перед удалением крови лягушки, нужно подготовить "стеклянной иглы", потянув стерильной пипетки Пастера над пламенем. Штрафа оконечности пипетки заточенный под стереомикроскопа. Пипетки затем подключается к пластиковой трубкой аспирации.
   Все инструменты, такие как щипцы и ножницы должны быть автоклаве перед использованием.
2. Также приготовьте ледяной 10 мл АФГ и раствор гепарина, добавив 50 единиц гепарина на 1 мл АФГ. Хранить раствор на льду. Все решения, используемые должны быть стерильными.
3. Обезболить лягушки, как описано в 3.7, и следуйте же животного процедур обработки, как описано в пункте 5.1. .
4. Вырезать кожи над задней ногой подвергатьспинной вены лапки.
5. Заполните пипетку Пастера с 1-2 мл АФГ + раствор гепарина.
6. Вставить "стекло иглу" в вену и начать собирать кровь медленно аспирационных ртом. Важно иметь АФГ + раствор гепарина в "стеклянной иглы", так как это позволит предотвратить свертывание крови и засорение кончика иглы.
7. От 1 до 2 мл крови может быть получена из одного среднего размера лягушки.
8. Небольшой разрез на ноге лягушки не нужно шить и рана заживает в течение одной недели.
9. Центрифуга крови при 1000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C.
10. Удалить супернатант и промыть клетки 1X по 10 мл холодной АФГ.
11. Наложение 2 мл крови (1-5 х 10 ^{6 клеток)} на 1 мл Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma), предварительно нагревают при комнатной температуре, чтобы отделить лейкоцитов крови от красных кровяных телец.
12. Центрифуга 20 мин при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре без тормозов, а затем собирать лейкоцитов группы.
13. Вымойте клетки 2X с АФГ путем центрифугирования при 1400 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° С для удаления остаточных Ficoll.
14. В этот момент клетки готовы к окрашивали антителами для анализа потока цитометрии, а если быть использовать для анализов в лабораторных культуры.

8. Опухоль Пробирной трансплантации

1. Примерно за неделю до эксперимента оттаять новую партию 15 / 0 опухолевые клетки и убедитесь, что клетки начинают расти хорошо. Культура среды кратко описаны в следующем разделе, а более подробно в ^3.
2. Развернуть 15 / 0 опухолевые клетки.
3. В день эксперимента, граф клеток и определить гибель клеток путем исключения Трипановый синий. Гибель клеток должна быть не менее 5%. Вымойте клетки 1X в холодной АФГ и центрифуге при 1000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 10 мин.
4. Ресуспендируют клеток в опухоли культуральной среде при плотности 5 х 10 ⁵ 15 / 0 клеток в 300 мкл.
5. Пересадка 5 х 10 ⁵ клеток в 300 мкл объем, приходящийся на лягушку в виде подкожных инъекций применяют 25 калибр 5 / 8 иглой на одной стороне спинной (назад) стороне животного.
6. Рост опухоли начнется в течение 2-3 недель после опухоли вызов. Первоначальный вид опухоли должны быть отмечены и объем опухоли должно быть записано через каждые 2-3 дней. Объем опухоли (высота х длина х ширина) измеряется с помощью суппортов.
7. Как только опухоль вырастает до 3500 мм ³ или лягушка начинает искать вялым, она должна быть умерщвлены, чтобы предотвратить дискомфорт.

9. Реагенты Нужно:

• Амфибия фосфатным буферным солевым раствором (АФГ): 6,6 г / л NaCl, 1,15 г / л Na ₂ HPO _4, 0,2 г / л KH ₂ PO. рН до 7,5 использованием 10N NaOH и фильтр стерилизовать через фильтр 0,2 мкм.
• Tricaine метана сульфанат (TMS, MS-222) (Полумесяца Химические CAS # 886-86-2).
• Бикарбонат натрия (Fisher Scientific S-233-500).
• Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 мл)
• Гепарин натриевая соль (Sigma-Aldrich H3149-50KU)
• Культура средой для Xenopus 15 / 0 опухолей [см. 3 для более подробной информации]: 1 л Айскоув DMEM базальной среды (Gibco Invitrogen-11965) с 10 мл инсулина, 10 мл без незаменимых аминокислот, 10 мл пенициллина стрептомицин, 10 мкг / мл канамицина, 3 мл primatone (Шеффилд Products Division), 1 мл β2-меркаптоэтанол, и 3,02 г NaHCO ₃ в воде (рН 7,0). Эта среда разбавляют до амфибий осмолярность, добавив 30% дистиллированной воды, и с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 20% superantant из ячейки Xenopus A6 линии почки, и 0,25% от нормального Xenopus сыворотки.

10. Представитель Результаты

Рисунок 1. Stereomicroscopic анализ кожи отторжения трансплантата через 12 дней после трансплантации. LG-6 клонированные лягушки получил кожного лоскута с любой () MHC-идентичными LG-6 (не показывает отклонение) или (В) MHC-разрозненных беспородных доноров (80% отклонения). Стрелками показаны серебристым iridophore пигментных клеток маркировки здоровых (не отклонены) пересаженной ткани. (*) Знак щипцов не из-за отказа.

Рисунок 2. Gp96 способствует кросс-презентация опухолевых антигенов в Xenopus. LG-15 ЯП (5 х 10 ⁵⁾ были импульсных в течение 1 часа на льду, либо с АФГ (отрицательный контроль), 1 мкг рекомбинантного gp96 очищают от E. Coli культуры, или на 1 или 0,5 мкг gp96 очищают от 15 / 0 опухолевой ткани. После 3 мойки, клетки восприимчиво переданы в LG-15 получателей взрослых (1 х 10 ⁶ / индивидуальный). Через три дня, живут 15 / 0 опухолевые клетки (5 х 10 ⁵⁾ былипересаженные в виде инъекций подкожно. Каждая кривая представляет кинетики роста опухоли в одну лягушку. Дней после заражения, когда опухоль впервые появилась наблюдали, и размер опухоли был определен периодически (длина х ширина х толщина) суппорта.

Обсуждение

Амфибии Xenopus является уникальным универсальным не-млекопитающих модель для изучения иммунитета. Его широко используют в биомедицинских и иммунологические исследования дали во многих важных исследовательских инструментов, таких как МНС определена клонов LG-6 и LG-15, а также различные линии клеток и моноклональных антител. Используя эти инструменты, которые мы установили различные в пробирке и в естественных условиях анализов для изучения способности белков теплового шока, такие как gp96 пос...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<сильный>Необходимые реагенты:
Фосфатно-солевой буфер для амфибий (APBS):
NaCl, 1,15 г/л
Na2HPO4, 0,2 г/л
KH2ПО
10Н NaOH
Метансульфонат трикаина (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
Гидрокарбонат натрия	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100 мл
Гепарин натрия	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Питательная среда для опухолей Xenopus 15/0 [подробности см. в пункте 3]:
базальная среда Iscove DMEM	GIBCO, производства Life Technologies	11965
Инсулин
Незаменимые аминокислоты
Пенициллин-стрептомицин
Канамицин
Primatone	Подразделение продуктов Sheffield
β2-меркапто–этанол
NaHCO3
30% дважды дистиллированной воды
5% эмбриональная бычья сыворотка
20% супернатанта клеточной линии почек Xenopus A6
0,25% нормальной сыворотки Xenopus
<сильный>Материалы и оборудование:
стерильные конические центрифужные пробирки объемом 50 и 15 мл
стерильные иглы Precision Glide, калибр 25G, длина 5/8 дюйма	BD Biosciences
игла 18G 1½ стерильные иглы Precision Glide	BD Biosciences
стерильный туберкулиновый шприц объемом 1 мл с конусом типа Slip Tip	BD Biosciences
стерильный шприц с конусом Slip объемом 10 мл	BD Biosciences
Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (стерильные)
Стерильные полистирольные чашки Петри 60 x 15 мм	Falcon BD
Лезвия бритвы
Предметные стекла премиум-класса 25 x 75 мм x 1 мм	Fisher Scientific
стеклянные чашки Петри диаметром 10 см
9" Одноразовые пастеровские пипетки Durex из боросиликатного стекла с хлопковой пробкой	VWR international
трубки Tygon
Две швейцарские ювелирные иглы № 5’Пинцет	Miltex Inc.
Микродиссекционные пружинные ножницы McPherson-Vannas, прямая режущая кромка 6 мм	Roboz Surgical Instruments Co.
Штангенциркули Helios
Стереомикроскоп
Высокоинтенсивный осветитель
Гемоцитометр
Горелка Бунзена
37°инкубатор-шейкер
Центрифугирование