Toxoplasma гондий превращается в кисту форме в ответ на экологические стрессы, которые могут быть передразнил в моделях культуры тканей. Это видео демонстрирует методы для проверки образованию кист стене путем активации костномозгового происхождения макрофагов или изменении рН среды роста фибробластов в клетках.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Toxoplasma Киста гондий стены Образование в Активированный костномозгового происхождения Макрофаги и Bradyzoite условия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Toxoplasma гондий является облигатным внутриклеточным паразитом, которые могут проникать любые ядерные ячейки теплокровных животных. Во время инфекции, Т. гондий распространяет в качестве быстрого тиражирования форму, которая называется tachyzoite. Tachyzoites превращаются в медленно растущих осумкованный форму, которая называется bradyzoite по сигнализации процесс, который не очень хорошо охарактеризованы. В животных, bradyzoite кисты находятся в центральной нервной системы и мышечной ткани и представляют собой хроническую стадию инфекции. Преобразование в bradyzoites можно смоделировать в культуре ткани СО 2 голод, используя среде с высоким рН, или добавлением интерферона гамма (IFNγ). Bradyzoites характеризуются наличием кисты стене, к которой лектин Dolichos biflorus агглютининов (DBA) связывает. Флуоресцентно меченных DBA используется для визуализации кисты стене у паразитов, выращенные в человеческие фибробласты крайней плоти (HFFS), которые были выставлены низкие CO 2 и высоким рН среды. Кроме того, паразиты, проживающих в мышиной костномозгового происхождения макрофагов (BMMs) дисплей стенки цисты обнаруживаются DBA после BMMs активируются с IFNγ и липополисахарида (ЛПС). Этот протокол будет показано, как вызвать преобразование T. гондий к bradyzoites использованием высокой питательной среде с низким рН 2 CO и активации BMMs. Клетки-хозяева будут культивировали на покровных, инфицированных tachyzoites и либо активированный с добавлением IFNγ и LPS (BMMs) или подвергается высокой питательной среде рН (HFFS) в течение трех дней. После завершения инфекции, клетки-хозяина будет исправлено, проницаемыми, и блокировали. Киста стены будут визуализированы использованием родамина DBA с флуоресцентной микроскопии.
Протокол
1. Подготовка человеческие фибробласты крайней плоти (HFF)-покрытием покровные
- Место стерильные круглые покровного стекла на дне лунки 24-луночного планшета для культуры ткани.
- Для уборки HFFS из сливной 150см 2 колбы, промыть колбу дважды 1X PBS и добавить 2,5 мл 0,025% трипсина-EDTA. Инкубируйте колбы при 37 ° С в течение 5-10 минут.
- Нажатие стороне колбы с ладонь может помочь в отсоединения клеток из колбы. Как только клетки выпустили из колбы, добавляют 150 мл HFF среды (Дульбеко изменения Eagle Средний [DMEM] с 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, и 1% пенициллина стрептомицин) и использования средних промыть колбу и собирать клет....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя механизм развития bradyzoite до конца не изучен, молекулярно-генетический анализ Т. гондий стадии преобразования в культуре тканей привело к открытию генов, которые вовлечены в bradyzoite образованию кист 2,3,4. Анализ также привели к наблюдению, что некоторые bradyzoite маркеров, выраженных в иных условиях длительного стресса, в том числе рост активированными макрофагами 5,6. Выше способов описать, как вырастить Т. гондий и вызывают развитие DBA положительные структуры стены.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана Университета Висконсин-Мэдисон Герман И. Шапиро Уважаемые стипендий (CMT), NIH награду AI072817 (AMP) и Американской ассоциации сердца премии 0840059N (LJK).....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Дульбекко’модифицированная среда Игла в Дулозе (DMEM) | GIBCO, от Life Technologies | 11960-051 | |
| Фетальная бычья сыворотка (ФБС) | Atlanta Biologicals | S11150 | термически инактивировать |
| Родамин <электронная микроскопия>Dolichos biflorus агглютинин | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| Формальдегид (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Глицин | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| ИФНγ | PeproTech Inc | 315-05 | Хранить в аликвотах для однократного использования |
| L-глутамин (200 мМ) | GIBCO, компания Life Technologies | 25030 | |
| Липополисахарид (ЛПС) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Хранить в аликвотах для однократного использования |
| Предметное стекло для микроскопа | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| Пенициллин-стрептомицин | GIBCO, компания Life Technologies | 15140 | |
| порошок среды RPMI 1640 (с L-глутамином, без бикарбоната) | GIBCO, производства Life Technologies | 31800-022 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%) | GIBCO, от Life Technologies | 25200 | |
| Монтирующая среда VectaShield с DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
Ссылки
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
