Для развития РНК-интерференция (RNAi)-терапии на основе, новая стратегия была разработана, transkingdom RNAi (tkRNAi). Эта технология использует непатогенных бактерий производить и доставлять терапевтические короткие шпильки РНК (shRNA) в клетки-мишени. Здесь tkRNAi был успешно применен для разворота классической ABCB1-опосредованной множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) раковых клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Бактериальные Доставка RNAi создания эффектов: Transkingdom RNAi
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
РНК-интерференция (RNAi) представляет собой высокий эффективный механизм для специфического ингибирования экспрессии мРНК. Кроме того его потенциал в качестве мощного инструмента лаборатории, путем РНК-интерференции, кажется, перспективных для использования в терапевтических использования. Для развития РНК-интерференция (RNAi)-терапии на базе, доставка RNAi-посреднических агентов к клеткам-мишеням является одним из основных препятствий. Новая стратегия для преодоления этого препятствия является transkingdom RNAi (ТК RNAi). Эта технология использует непатогенные бактерии, например, кишечная палочка, производить и доставлять терапевтические короткие шпильки РНК (shRNA) в клетки-мишени, чтобы побудить RNAi. Первого поколения, т.к. RNAi-посреднической вектор, TRIP, содержит промотор бактериофага Т7 для регуляции экспрессии терапевтического shRNA интересов. Кроме того, поездка Инв локус от псевдотуберкулеза Yersinia, который кодирует invasin, что позволяет природного неинвазивной бактерии войти β1-интегрин-положительных клеток млекопитающих и ген HlyA от Listeria моноцитогенес, который производит listeriolysin О. Этот фермент позволяет терапевтических shRNA вырваться из вступления пузырьков в цитоплазме клетки-мишени. TRIP конструкции вводятся в компетентные непатогенных кишечной палочки штамма, который кодирует РНК-полимеразы Т7 необходимые для Т7 промотор-приводом синтез shRNAs. Хорошо характеризуется рак связаны молекулы-мишени для различных стратегий RNAi является ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Это ABC-транспортер действует как насос наркотиков экструзии и посредником "классической" ABCB1-опосредованной множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) фенотип человеческих раковых клеток, которое характеризуется определенной схеме сопротивление крест. Различные ABCB1-клеток, экспрессирующих MDR рака лечили с анти-ABCB1 shRNA вектор экспрессии подшипников Е. палочки. Эта процедура привела к активации пути RNAi в раковые клетки и значительное вниз регулирования ABCB1 кодирования мРНК, а также соответствующий насос экструзии препарата. Таким образом, кумуляция препарата была повышена в нетронутых лекарственной устойчивостью раковых клеток и фенотипом МЛУ было отменено. С помощью этой модели данных предоставляют доказательства правильности концепции, что т.к. RNAi подходит для модуляции рак сопутствующих факторов, например ABCB1, в человеческих раковых клеток.
Протокол
1) Бактериальные Доставка shRNAs
- Перед тем как начать с бактериальной культурой, надо подготовить LB-средой и LB-агар.
- Для LB-средой отвешивать дрожжевой экстракт (0,5% м / о), Бакто триптон (1,0% м / о) и NaCl (0,6% м / о) и разбавить эти компоненты в царской bidest. Подготовлены решения должны быть стерилизованы в автоклаве, а затем готовых к использованию.
- Для LB-агаром Бакто агар (1,5% м / о) должна быть добавлена к LB-среды до стерилизации.
- Нагрейте LB-агар в микроволновой печи до LB-агар полностью не растворится. Пусть решение остыть до бутылки могут быть затронуты легко, без получения ожогов. Добавить канамицин (100 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Номер ячейки отобранный для инфекции и соответствующие МВД использовали, критически зависят от клеточных линий под наблюдением и их скорость роста. Чтобы найти оптимальное количества клеток для посева, предварительно экспериментов, чтобы определить скорость роста настоятельно рекомендуется. Кроме того, различные Mois должны быть проверены из-за ограниченного распространяется на которой клетки могут стоять бактериальной инвазии, не умирая от стресса. Оптимальной точке времени, когда вниз регулирования гена под наблюдение.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке гранта нет. 01GU0615 из "Bundesministerium für Forschung унд Technologie (BMBF).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Агар | Biochrom AG | 214050 | |
| Амфотерицин B | Biochrom AG | A2612 | |
| Фосфатно-солевой буфер Дюльбекко-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | Каталожный номер отсутствует, прямой заказ | |
| Гентамицин | Biochrom AG | A2710 | |
| Пенициллин/Стрептомицин | Invitrogen GmbH | Содержит 5,000 единиц пенициллина (основание) и 5,000 μg стрептомицина (основание)/мл с использованием пенициллина G (натриевая соль) и сульфата стрептомицина в 0.85% физиологическом растворе. | |
| Хлорид натрия | Merck KgaA | 1064060500 | |
| Тритон | Difco Laboratories | 211705 | |
| Дрожжевой экстракт | Difco Laboratories | 212750 |
Ссылки
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
