В электропорации внутриутробно является ценным методом трансфекции клеток-предшественников нейронов в живом организме. В зависимости от размещения электродов и развития timepoint электропорации, некоторые подмножества клеток коры могут быть направлены. Целевые клетки могут быть проанализированы в естественных условиях или в пробирке для воздействия генетических изменений.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Внутриутробное Электропорация последующей первичной нейронов культуры для изучения функции генов в Подмножество корковых нейронов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В пробирке изучение первичных нейронов культур позволяет количественного анализа аксонов. Для того, чтобы изучить, как генетические изменения влияют на нейронные результатом процесса, shRNA или кДНК конструкции могут быть введены в первичные нейроны с помощью трансфекции химического или вирусной трансдукции. Тем не менее, с первичным корковых клеток, гетерогенных бассейн типов клеток (нейронов глутаматергической из разных слоев, тормозящие нейроны, глиальные клетки) трансфекции с помощью этих методов. Использование внутриутробно электропорации ввести конструкций ДНК в эмбриональных коре грызунов допускает определенные подмножества ячеек, которые будут целевые: в то время электропорации ранней эмбриональной коры цели глубоких слоях коры, электропорации на поздних эмбриональных timepoints цели более поверхностные слои. Кроме того, дифференциальные размещения электродов через головы отдельных результатов эмбрионов в адресности спинно-медиальной по сравнению с вентральной-боковых отделах коры. После электропорации, трансфицированных клеток можно разрезать из, диссоциированных и покрытие в пробирке для количественного анализа аксонов. Здесь мы предоставляем шаг за шагом метод количественного измерения нейронов результатом процесса в подмножествах корковых клеток.
Базового протокола в электропорации внутриутробно была подробно описана в двух других статьях Юпитера от Kriegstein лаборатории 1, 2. Мы предоставим обзор наших протокол электропорации в матке, уделяя особое внимание наиболее важные детали, за которым следует описание нашего протокола, который применяется в электропорации внутриутробно для изучения функции генов в нейронных результатом процесса.
Протокол
Базового протокола в электропорации внутриутробно был подробно описан в другой статье от Юпитера Kriegstein лаборатории 1, 2. Эта методика была впервые описана в Osumi лаборатории 3 и наш протокол основан на одной из развитых в LoTurco лаборатории 4. Мы предоставим обзор протокола для наших внутриутробно электропорации крысиных эмбрионов, сосредоточив внимание на наиболее важных деталях, а затем описание нашего протокола, который применяется во внутриутробном электропорации для изучения функции генов в нейронных результатом процесса.
1. В Электропорация внутри....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В пробирке изучение первичных нейронов культур позволяют количественного анализа аксонов. Для того, чтобы изучить, как генетические изменения влияют на нейронные результатом процесса, shRNA или misexpression конструкции могут быть введены в первичные нейроны с помощью трансфекции химического или вирусной трансдукции. Тем не менее, с первичным корковых клеток, гетерогенных бассейн типов клеток (нейронов глутаматергической из разных слоев, тормозящие нейроны, глиальные клетки) трансфекции с помощью этих методов. .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Иосифа LoTurco и Деннис Selkoe за полезные дискуссии на эту технику. Авторы выражают благодарность донорам Американский фонд содействия здравоохранению, за поддержку этого исследования.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10X раствор Ханкса’ Сбалансированный солевой раствор (HBSS) (с Ca)+2 /Mg +2 бесплатно) | GIBCO, от Life Technologies | 14185-052 | |
| 10X раствор Ханкса’ Сбалансированный солевой раствор (HBSS) (с Ca2+)+2 /Mg +2 ) | GIBCO, производства Life Technologies | 14065-056 | |
| 1М HEPES pH 7,4 | GIBCO, производства Life Technologies | 15630-080 | |
| Чашки Петри 100 x 15 мм | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Чашки Петри 60 x 15 мм | BD Biosciences | 351007 | |
| коническая пробирка объемом 15 мл | Sarstedt Ltd | 62-547-205 | |
| коническая пробирка объемом 50 мл | Sarstedt Ltd | 62-554-205 | |
| Ножницы | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Стандартный пинцет | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Изогнутые пинцеты | Fine Science Tools | 11273-20 | |
| Прецизионный пинцет | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| пружинные ножницы Ваннаса | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 0,25% трипсин-ЭДТА | GIBCO, производства Life Technologies | 25200 | |
| Гемоцитометр Reichert Bright-Line | Hausser Scientific | 1490 | |
| Ручной счетчик-таллиер | Sigma-Aldrich | Z169021 | |
| Дюльбекко’модифицированная среда Игла в Дулозе (D-MEM) | GIBCO, компания Life Technologies | 11960-051 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Пенициллин-стрептомицин | GIBCO, компания Life Technologies | 15140 | |
| L-глутамин | GIBCO, от Life Technologies | 25030 | |
| среда NEUROBASAL | GIBCO, от Life Technologies | 21103-049 | |
| Безсывороточная добавка B-27 | GIBCO, от Life Technologies | 17504-044 | |
| Добавка GlutaMAX -I | GIBCO, компания Life Technologies | 35050-061 | |
| Реагентный раствор гентамицина | GIBCO, by Life Technologies | 15750-060 | |
| Параформальдегид | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Фосфатно-солевой буферный раствор | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Сыворотка осла | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| антитела к бета-III-тубулину | Chemicon International | MAB1637 | |
| антитело к MAP2 | Chemicon International | AB15452 | |
| антитела осла anti-mouse Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-166-151 | |
| осел Cy2 антитела против куриных антител | Jackson ImmunoResearch | 703-226-155 | |
| DAPI | GIBCO, производства Life Technologies | D3571 | |
| Двухкамерные стекла с покрытием CC2 | Lab-Tek | 154852 | |
| Флуоресцентные среды для заключения препаратов | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Микропредметные стекла 24 x 60 мм | VWR international | 48393-106 | |
| Прозрачный лак для ногтей | Электронная микроскопия | 72180 | |
| Кетамин | Henry Schein | 995-2949 | |
| Ксилазин | Henry Schein | 4015809TV | |
| бупренорфин | Henry Schein | 1118217 | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corporation | ||
| электропоратор с прямоугольной волной BTX | Fisher Scientific | BTXECM830 | |
| Твизероды, 7 мм, платина | Harvard Apparatus | 450488 |
Ссылки
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
