Выражение, детергентов солюбилизации и очистки Мембранные Transporter, сопротивление MexB множественной лекарственной белка

Summary

В этом протоколе мы демонстрируем выражения, солюбилизации и очистки рекомбинантно выразил мембранный белок, MexB, как растворимый комплекс моющих средств белка. MexB является множественной лекарственной транспортер сопротивление мембраны от оппортунистических бактериальных патогенов синегнойной палочкой.

Abstract

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), способность раковых клеток или возбудителя устойчивы к широкому кругу структурно и функционально не связанных противораковых препаратов или антибиотиков, в настоящее время является серьезной проблемой в области общественного здравоохранения. Это множественная лекарственная устойчивость во многом объясняется энергозависимых насосов наркотиков истечения. Насосы изгнать противораковых препаратов или антибиотиков во внешнюю среду, снижая их внутриклеточной концентрации ниже токсичного порога. Мы изучаем множественной лекарственной устойчивостью в синегнойной палочки, оппортунистических бактериальный возбудитель, который вызывает инфекции у больных со многими типами травмы или болезни, например, ожогов или кистозный фиброз, а также в с ослабленным иммунитетом рака, диализа и трансплантации пациентам. Основные MDR откачивающих в P. палочки являются трехсторонние комплексы состоят из внутренней оболочки протона с наркотиками антипортера (РНД), внешний канал мембраны (OMF), а периплазматического белка компоновщика (МФУ) ^1-8. РНД и OMF белки трансмембранных белков. Трансмембранных белков составляют более 30% всех белков и 65% от текущей лекарственных препаратов. Гидрофобных трансмембранных доменов делают белки нерастворимы в водном буфере. Перед трансмембранный белок может быть очищена, необходимо найти буфера условиях, содержащих мягкого моющего средства, которые позволяют белка в раствор, как белковый комплекс моющих средств (PDC) ^9-11. В этом примере мы используем RND белка, П. палочки MexB трансмембранного транспортер, чтобы продемонстрировать, как выразить рекомбинантная форма трансмембранного белка, растворить его, используя моющие средства, а затем очистить белковых комплексов моющего средства. Этот общий метод может быть применен к выражению, очистка и солюбилизации многих других рекомбинантно выразил мембранных белков. Белковых комплексов моющего средства в дальнейшем могут быть использованы для биохимических и биофизических характеристик в том числе рентгеноструктурного определения структуры или сшивания исследований.

Protocol

1. День 1:

MexB с синегнойной палочкой кодируется pFB101. Ген MexB усиливался из P. палочки геномной ДНК и вставляют в NdeI и XhoI ограничение сайты pET30b векторных. Построить содержит С-концевой hexahistidine тега.

1. Плазмиды используется для преобразования Е. палочки штамма C43 (DE3) ^12, и трансформанты высевают на LB агар, содержащий 30 мкг / мл канамицина.

2. День 2: Ночь культуры:

2. Вечером, 4 х 3 мл LB культур, содержащих 30 мкг / мл канамицина засевают из свежих колоний трансформантов. Кроме того, культуры могут быть прививки от замороженных химическую завивку.
   Эти небольшие культур, выращенных на ролик при 37 ° С в течение ночи.

3. День 3: Рост 6 литров культур:

3. По утрам, используйте ночь культур привить 150 мл LB, содержащей 30 мкг / мл канамицина. Рост культуры при 37 ° С на качалке.
4. Во второй половине дня, используйте небольшие культуре привить 6 х 1 л 2XYT среде, содержащей 30 мкг / мл канамицина в колбах FERNBACH. (Используйте 25 мл на культуру для разбавления 1:40). Рост культуры при 37 ° С до достижения ими OD ₆₀₀ из 0.4-0.6, около 1,5 часов
5. Когда культур достигают надлежащей плотности, индуцируют экспрессию белка путем добавления 0,5 мл 1М IPTG. Положите все колбы еще в шейкере и продолжают выращивать их при температуре 30 ° С в течение ночи.

4. День 4: Уборочная клетки и очистки белков:

6. Добавить ингибиторы протеазы, ДНКазы, и лизоцима в буферных растворов следующим образом: до 50 мл клеточной буфера ресуспендирования, добавляют 10 мг DNaseI (0,1 мг / мл, конечная концентрация), 1 Полное ЭДТА без ингибитора протеазы таблетка, и щепотка лизоцима . К 60 мл мембраны буфера ресуспендирования, добавить 1 ингибитор протеазы таблетки. Чтобы еще 50 мл мембраны буфера ресуспендирования, добавить 1 ингибитор протеазы таблетки. Держите все три решения на льду.
7. Центрифуга культур 30 мин 5000 оборотов в минуту в крупномасштабных центрифуги для сбора клеток.
8. Ресуспендируют клеток в 100 мл ячейки ресуспендирования буфера (50 мМ NaP, рН 7,0, 300 мМ NaCl, 2 мМ MgCl _2, 1 Полное ЭДТА без ингибитора протеазы таблетка, 0,1 мг / мл ДНКазы I, щепотка лизоцима)
9. Pass клетка решение дважды через французский ячейке давление на 12000 фунтов на квадратный дюйм (762 манометра). Сбор Клеточный лизат в бутылке держать в холоде на льду.
10. Передача Клеточный лизат для SS34 центрифужные пробирки и центрифуги для удаления мусора клетка в течение 30 мин при 10 000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в СС-34 ротор.
11. Осторожно удалите супернатант в Ti647.5 труб ультрацентрифуге. Центрифуга 50 мин при 40 000 оборотов в минуту при 4С. Удалите супернатант.
12. Ресуспендируют шарик, который содержит клеточные мембраны, в ок. 25 мл буфера ресуспендирования мембраны (50 мМ NaP, рН 7,0, 300 мМ NaCl, 5% глицерина, 1 полная ЭДТА без ингибитора протеазы таблетка).
13. Передача суспензии мембран в чистую пробирку центрифуги и центрифуге при 40 000 оборотов в минуту в Ti647.5 ротора в течение 50 минут при 4 ° C.
14. Удалите супернатант и ресуспендируйте мыть мембраны гранул в 25 мл буфера ресуспендирования мембраны (50 мМ NaP, рН 7,0, 300 мМ NaCl, 5% глицерина, 1 полная ЭДТА без ингибитора протеазы таблетка).

5. ТМ белка Solublization:

15. Для ресуспендировали мембран (около 25 мл), добавляют 6 мл 10% DDM (конечная концентрация моющих средств = 2% DDM) Рок смесь при температуре 4 ° С в течение 2 часов.
16. Центрифуга смеси при 40 000 оборотов в минуту в течение 40 мин при 4 ° С в Ti647.5 ротором для разделения растворимых комплексов моющего средства белка из нерастворимые белки. Сохранить супернатант, который содержит MexB комплексов моющего средства белка.

6. IMAC:

17. Смешайте надосадочной жидкости, полученной от высокой скорости вращения с металлом коготь близость бисером уравновешенную ресуспендирования буфера. Инкубировать 1 час на роликах при 4 ° C.
18. Налейте шлама в колонке тела самотеком и отказаться проходить через.
19. Промыть колонку с 20 мл (10 томов столбца) IMAC Связывание и промывочного буфера (50 мМ NaP, рН 7, 300 мМ NaCl, 5% глицерин, 0,2% DDM)
20. Элюции белка с IMAC буфера элюирования (50 мМ NaP, рН 7,0, 300 мМ NaCl, 5% глицерина, 250 мМ имидазола, 0,2% DDM).
21. Возьмите 15 мкл образцов элюирования фракций, смешать каждый с 15 мкл образца 2X SDS буфера для анализа электрофореза в полиакриламидном геле. Спиновые 30 сек в микроцентрифужных. Анализ образцов на 10% полиакриламидном геле SDS оценить количество и чистоту MexB в каждой фракции.
22. Бассейн Фракции, содержащие белок MexB моющего средства комплексов и концентрируют их в спину концентратор на 4 ° С. Будьте осторожны, чтобы белок не выпадают в это сТЭП.

7. Колонка гель-фильтрации:

23. Предварительно равновесие Superose 12 HL 30/10 колонку с 24 мл работает буфера (50 мМ NaP, рН 7,0, 300 мМ NaCl, 5% глицерин, 0,2% бета-octylglucoside), и ждать плоской линии.
24. Промыть загрузки Akta системы петля с работы буфера.
25. Фильтры раствора белка при помощи шприца фильтра перед его применением к колонке.
26. Нагрузка до 240 мкл раствора белка на колонке, с концентрацией белка до 5 мг / мл.
27. Выполнить 1,5 колонке объемов (36 мл) буфера, собрать 0,25 мл фракции. MexB белковых комплексов моющего средства должны элюировать как пика на уровне около 10 - 15 мл элюирования объема.
28. Возьмите 5 мкл образцов пик фракций. Смешайте каждого образца 1:1 с 2Х буфером образец SDS. Анализ образцов на 10% полиакриламидном геле оценить количество и чистоту MexB в каждой фракции
29. Бассейн фракций, содержащих чистый MexB.

8. Представитель Результаты:

Рисунок 1 включает в полиакриламидном геле с объединенные колонки фракций из IMAC колонки и отдельных фракций из колонки гель-фильтрации. После колонке гель-фильтрации белков появляется чистая от окрашенных Кумасси полиакриламидном геле. Рисунок 2 включает в себя след из колонки гель-фильтрации, рассказывающие об основных пика белковый комплекс моющих средств элюирования из колонки. Средняя урожайность белка MexB составляет приблизительно 2 мг в 6 литров 2XYT культуры.

Рисунок 1. SDS-PAGE гель очистки РРЦ MexB. Лейн 1, маркеры молекулярного веса. 2, Объединенные IMAC фракций. 3-7, гель фракции фильтрации столбцов.

Рисунок 2. Пример гель-фильтрации Результаты MexB белка моющего средства комплексов (PDC).

Discussion

В дополнение к лекарственной устойчивости, многие жизненно важные клеточной активности, в том числе транспорт ионов, межклеточной коммуникации, транспорт везикул, поддержание клеточной структуры, а хозяин-патоген взаимодействия, связаны с белками, которые встраиваются в клеточные мембраны. Трансмембранных белков составляют более 30% известных белков и являются целью для большинства фармацевтических препаратов, используемых сегодня. Неправильное складывание или активность трансмембранных белков приводят к важным генетиче...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SDS буфер для проб	Bio-Rad	161-0737
C43(DE3) E. coli штамм	Lucigen	60345-1
канамицина сульфат	Sigma-Aldrich	K4378
2XYT медиа	Fisher Scientific	BP2466-2
LB медиа	Fisher Scientific	AC61189-5000
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
DNaseI	Fisher Scientific	BP3226-1
Лизоцим	Sigma-Aldrich	L7651
Таблетки полного ингибитора протеазы без ЭДТА	Roche Group	11 873 580 001
NaP моноосновной	Sigma-Aldrich	S6566
NaP двухосновной	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
MgCl2	Sigma-Aldrich	M1028
Глицерин	Fisher Scientific	BP229-1
n-dodecyl-β-D-мальтопиранозид	Anatrace	D310
15мл тубы	Corning	430052
See-Saw Rocker	Fisher Scientific	SSL 4
Talon металлическая аффинная смола	Clontech Laboratories	635503
имидазол	Sigma-Aldrich	I5513
10% полиакриламид SDS PAGE гели	Bio-Rad	161-1454
Tris/glycine/SDS PAGE беговой буфер	Bio-Rad	161-0732
Kaleidascope предварительно окрашенные молекулярные маркеры	Bio-Rad	161-0324
Superose 12 30/10 колонка	GE Healthcare	12 10/300 GL
Центробежный концентратор Amicon	EMD Миллипоровый	UFC801024
Шприцевой фильтр	Fisher Scientific	SLFG R04 NL
Фернбах колбы	Fisher Scientific	09-552-39
Шейкер для удержания колб Fernbach	Fisher Scientific
Akta system	GE Healthcare
J6 Крупногабаритная центрифуга с ротором JLA-8.1000	Beckman Coulter Inc.
Центрифуга объемом 1 л Beckman	Coulter Inc.
Центрифуга RC-5	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Ротор и трубки SS34 с фиксированным углом наклона	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Напольная модель Сорвалл Ультрацентрифуга	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Ротор T647.5 и трубки с крышками	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08322
Французская ячейка давления	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ФА-032