Методическая статья

Визуализация Эмбриональные нервной системы в целом монтажа Drosophila Эмбрионы

DOI:

10.3791/2150

⸱

11 декабря 2010 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY-University at Buffalo

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем процедуру подготовки постановке Drosophila Эмбрионов для визуализации эмбриональной нервной системы в процессе эмбриогенеза.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриона дрозофилы является привлекательной моделью системы для исследования клеточных и молекулярных основ нейронных развития. Здесь мы опишем процедуру визуализации дрозофилы эмбриональной нервной системы с помощью антител к нейронов белки. Поскольку вся эмбриональных периферической нервной и центральной нервной системы хорошо характеризуется на уровне отдельных клеток (Dambly-Chaudière и др., 1986;.. Бодмер и др., 1987;. Бодмер и др., 1989), любые аберрации эти системы могут легко идентифицировать с помощью антител к различным нейронов белки. Развивающихся эмбрионов собираются в определенное время для того, чтобы эмбрионы в надлежащем стадиях развития для визуализации. После сбора, внешние слои эмбриона, мембраны хориона и конверт желточной, которая окружает эмбрион, удаляются перед фиксацией. Эмбрионы затем инкубировали с антителами нейронов и визуализировать использованием флуоресцентно меченых вторичных антител. Эмбрионы на стадии 12-17 визуализируются для доступа к эмбриональной нервной системы. На этапе 12 группы ЦНС зародыш начинает сокращение и этап 15 окончательные структуры спайка была достигнута. По стадия 17 ЦНС контрактов и ПНС полностью разработан (Кампос-Ортеги и соавт. 1985). Таким образом, изменения в структуре ПНС и ЦНС легко можно наблюдать во время этих стадиях развития.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка реагентов

  1. Подготовка буфера PEMFA использованием 100mM Трубы, 2мм EGTA и 1 мМ MgSO 4. Отрегулируйте рН буфера до 7,0. Буфера PEMFA является фильтр стерилизуют и хранят при 4 ° C.
  2. Подготовка PBT, добавляя 1 мл Тритон Х-100 до 100 мл 1x PBS (фосфатно-солевым буфером) (рН 7,0). Хранить при температуре 4 ° С.
  3. Подготовка 5% BSA (бычий сывороточный альбумин) с 0,01% в NaAcide 1x PBS (рН 7,0).
  4. Подготовка солевого раствора с использованием 0,7% NaCl и 0,03% Тритон Х-100 в деионизованной воде.
  5. Подготовка фиксатором, объединив 4 части PEMFA буфера с 1 частью 37% формальдегида.

2. Сборник Эмбрионы

  1. Подготовка клетки для штамма дрозофилы интересов путем размещения> 100 летит в пластиковые бутылки, содержащей адаптер с агар пластины кормления.
  2. Оставьте клетку мух в темноте при комнатной температуре в течение 72 часов, меняя пластин каждые 8-12 часов, так что мухи получить приспособиться к клетке и не подносите их яйца.
  3. Для эксперимента собирать эмбрионы в течение 12 часов. Снимите чашку Петри из контейнера и заменить его. Возьмите удалены чашку Петри и мыть эмбрионов с использованием блюдо физиологическим раствором и чистой щеткой краску.
  4. Сбор эмбрионов в мелкое сито. Промыть физиологическим раствором, чтобы удалить лишнюю дрожжей.
  5. Использование лопаточкой аккуратно подобрать эмбрионов и поместите их в небольшой стеклянный пузырек с крышкой. Добавьте приблизительно 1 мл физиологического раствора.

3. Удаление Хорион и Желточный Мембраны и фиксации

  1. После сбора эмбрионов, готовят гептан-Fix решение путем объединения 50% гептана и 50% фиксатором. Решение будет слоистых гептаном на вершине и фиксатор на дне.
  2. В стеклянный пузырек мыть эмбрионов путем инкубации их в солевой раствор в течение 5 минут. Удалите излишки солевой помощью пипетки Пастера.
  3. Промыть эмбрионы деионизированной водой.
  4. Dechorionate эмбрионов путем инкубации их в 50% отбеливателя в течение 3 минут.
  5. Промыть эмбрионы тщательно деионизированной водой.
  6. Fix эмбрионов путем инкубации их в течение 30 минут в гептан-Fix решение с осторожном встряхивании.
  7. С помощью пипетки Пастера заменить фиксатором (нижний слой) с метанолом оставляя гептана в трубке. Встряхивать удалить желточной оболочки. Devitellinized эмбрионов будет опускаться на дно трубы.
  8. Сбор эмбрионов в новый стеклянный пузырек помощью пипетки Пастера. Промойте эмбрионы в пять раз с метанолом, каждый раз, инкубировать эмбрионов в течение 5 минут.

4. Антитела окрашивание, монтаж, и визуализация

  1. Увлажняет эмбрионов в смеси 50% PBT решения и 50% метанола в течение 5 минут. Затем увлажняет в 100%-ный раствор PBT в течение 5 минут.
  2. Блок эмбрионов путем инкубации их в 5% БСА с 0,01% NaAcide решение в течение 1 часа при температуре 4 ° C.
  3. Эмбрионы теперь готовы на антитела окрашивания. Подготовка первичных антител путем разбавления его в соответствующей концентрации, используя 5% BSA с 0,01% NaAcide решение. Мы используем антител против белка цистеина строку (CSP), везикулярного синаптические белки и анти-HRP или пероксидазой хрена антитела, в котором признается нейронов конкретным содержанием углеводов фрагмент присутствует в поверхностных гликопротеинов и этикетки всех нейронов.
  4. Инкубируйте эмбрионов в течение ночи при 4 ° С в первичных решение антител.
  5. На следующий день, мыть эмбрионов в 10 раз с PBT в течение часа.
  6. Подготовка вторичного решение антител путем разбавления соответствующей концентрации. Мы используем Alexa вторичными антителами в концентрации 1:200.
  7. Инкубируйте эмбрионов в течение двух часов в 4 ° C на вторичном решение антител.
  8. Промыть эмбрионы 10 раз с PBT в течение часа.
  9. Инкубируйте эмбрионов на ночь в Vectashield Монтаж Средний.
  10. Горы эмбрионов на предметное стекло и печатью покровным стеклом с лаком для ногтей. Визуализация эмбриона использованием флуоресцентного микроскопа.

5. Представитель Результаты

figure-protocol-1
СКП
figure-protocol-2
HRP-FITC
figure-protocol-3
Объединенные
Рисунок 1: представитель изображения, показывающие эмбриональных ЦНС на стадии 16-17, используя антитела против CSP (красный) и HRP (зеленый). Обратите внимание на отличие окрашивание спайки.

figure-protocol-4
СКП
figure-protocol-5
HRP-FITC
"/>
Объединенные
Рисунок 2: представитель изображения, показывающие эмбриональных ПНС на стадии 16-17 с использованием антител против CSP (красный) и HRP (зеленый). Обратите внимание на повторяющиеся узоры периферических нейронов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриона дрозофилы это мощная система для исследования клеточных и молекулярных изменений во время развития нейронов. В этом протоколе мы продемонстрировали, как подготовить целых зародышей крепление для иммуногистохимии. Мы адаптировали данный протокол от протокол, описанный в Кэрролла и Скотт, 1985. Этот протокол также может быть адаптирована для тестирования других нейронов антител, но оптимизация антител должно быть сделано. Кроме того, дефекты развития зародышевого ПНС и ЦНС могут быть легко визуализирован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SG поддерживается за счет средств из государственного университета Нью-Йорка в Буффало и от Джона Р. Oishei Foundation.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
37% формальдегидFisher ScientificBP531-25
CSPDevelopmental Studies Hybridoma Bank
HRP-FITCJackson ImmunoResearch323-095-021
Alexa Fluor 568 козьи антитела к IgG мышиInvitrogenA-11004
Среда для заключения препаратов VectashieldVector LaboratoriesH-1000

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
  2. Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
  3. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
  4. Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
  5. Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи