$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка реагентов
- Подготовка подготовки рассечение буфер добавлением следующих соединений: 128 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 4 мМ MgCl 2, 2 мМ KCl, 5 мМ HEPES, и 36 мМ сахарозы в 1000 мл, рН до 7,2 и фильтр стерилизуют.
2. Подготовка к Dissection
- Siligard куба: гель сократить примерно на один дюйм шириной, 1 дюйма в длину и около 1 см высокие. Гель куб помещают на предметное стекло во время вскрытия. Кубы может быть использована более одного раза.
- Выводы: Выводы используются для вскрытия должны быть дополнительными короткими. Резкое часть нижней выводов minutien лучше всего работает в рассечение.
- Нужна одна острыми ножницами весной микродиссекции.
- Вам нужно два прекрасных наконечником щипцами.
3. Сборник Личинки
- Блуждающие 3-го возраста личинки, которые выражают GFP меткой пузырьков белка собираются на чашке Петри.
- Личинки промывают в деионизованной воде, чтобы избавиться от всех пищи.
4. Живая вскрытии личинок
- Личинка переходит к кубу рассечение гель на стекле. Личинка погружается в рассечение буфера.
- Личинка тосковал на передней и задней с помощью двух тонких булавок с спинной стороной вверх.
- Использование микродиссекции ножницы, небольшой надрез в средней линии у заднего конца. Из этого разреза надрез до передней. С помощью двух булавок, контактный вырезать кутикулу на боковых ребер.
- Добавить каплю рассекает буфера. Осторожно выньте кишки, кишечника и жира тела щипцами. Большинство из этих тканей обычно ила во время спинной резки.
- Замените буфер со свежими рассекает буфера. Личинка никогда не должны быть сухими и должны постоянно находиться в рассекает буфера.
- Инкубацию использованием в естественных условиях MitoTracker маркеров или LysoTracker сделаны в это время, путем разведения в естественных условиях маркер рассечение буфера. После инкубации в маркер естественных мыться расчлененный личинка несколько раз (5 быстрой мойки) с использованием свежих рассекает буфера.
- После замены последнего мыть толчок булавки в syligard и сразу же покровным. Личинки готов к наблюдению.
5. Живая съемка расчлененный личинки
- Место покровное и геля на столик микроскопа и изображения с помощью инвертированного микроскопа.
- Мы используем 100x линзы изображение меткой пузырьков внутри личиночной сегментарные нервы. GFP выражение в ячейке органов брюшной ганглий первую оценку до сегментарные нервы образ. Если надежные окрашивания GFP наблюдается в клеточных тел в брюшной ганглий, нервы то отображаемого и использоваться для оценки.
- Использование двойной системы представления с фильтрами для CFP / YFP или RFP / YFP и программного обеспечения с разделением мы можем одновременно два изображения меткой белка в естественных условиях.
6. Представитель Результаты
Рисунок 1:. Представитель изображение, показывающее многих аксонального пузырьки на многих аксонального треков в личиночной сегментарный нервный Примечание капли GFP, представляющих аксонального накоплений.
Рисунок 2: представитель изображение, показывающее один аксонального трек со многими аксонального пузырьков внутри личиночной сегментарный нерв.