Протокол денге инфекций в Комары (A. aegypti) и определение инфекции Фенотип

Краткое содержание

Как только ген определены как потенциально огнеупорные для вируса денге, он должен быть оценен для его роль в профилактике вирусных инфекций в комара. Этот протокол иллюстрирует, как степень инфицирования денге комаров могут быть проанализированы. Методы для посадки у вируса в культуре, мембранные кормления комаров человеческой крови, и опробование вирусные титры в комара кишки демонстрируются.

Аннотация

Целью этой процедуры является заразить комаров Aedes с вируса денге в лабораторных условиях и изучить уровень инфекции и динамика вируса в организме комара тканей. Этот протокол широко используется для изучения комаров вирус взаимодействия, особенно для идентификации новых факторов хозяина, которые способны определить вектор компетенции. Весь эксперимент должен проводиться в лаборатории BSL2. Как и Plasmodium тропической инфекции, соответствующая одежда, включая перчатки и халат следует носить в любое время. После эксперимента все материалы, которые были в контакте с этим вирусом, должны рассматриваться с 75% этанола и беленой прежде чем приступить к нормальной стирки. Все остальные материалы должны обрабатываться в автоклаве, прежде чем выбросить их.

Протокол

А. Распространить вирус в C6/36 клеточной линии.

1. Клетки растут на 80% слияния в 75 см ² колбы;
2. Удалить средах с 3-4 мл, оставшихся в колбу;
3. Возьмите 0,5 мл фондовом вирусов и добавить в выше ячейки с множественностью заражения 1,5 вирусных частиц в клетку. Встряхивания колбы в течение 15 минут медленно при комнатной температуре.
4. Инкубировать 45 минут при 5% СО ₂ и 37 ° C
5. Добавить 30 мл средствах массовой информации, и выдержать в течение 5 дней.

Б. Подготовка смеси вируса и крови

1. Отсоедините ячейки с скребок и передачи ячейки и СМИ 50 мл конические пробирки;
2. Центрифугата на 800 г в течение 10 минут; собирают супернатант, но оставить 1 мл надосадочной с осадок клеток;
3. Стоп выше осадок клеток в сухом CO _2, а затем оттепель в 37 ° С водяной бане, повторить два-три раза;
4. Центрифугата на 800 г в течение 10 минут, принимать супернатант, и в сочетании с надосадочной собранных с шага 3;
5. Сбор цельной человеческой крови с той же процедурой (шаг 3) для подготовки гаметоцит культуры инфицировать малярийных комаров с Plasmodium тропической;
6. Смешайте равное количество выше цельной человеческой крови с вирусом супернатант с шага 4, а также добавить сыворотке крови человека (10% от всего объема).
7. Инкубируйте выше смесь крови человека и вируса денге в течение 30 минут при 37 ° С водяной бане

Комаров С. Кормление

Эта процедура почти идентична той, что были описаны в разделе Plasmodium инфекций в тропической комаров. Мы анализа кишки инфекции на 7 день, и слюнных инфекции на 14 день после того, питающимися кровью. Все материалы, которые были в контакте с вирусом рассматриваются сначала с 75% этанола, а затем с 10% гипохлоритом натрия.

Д. Анализ титра вируса в тканях комара

1. Два или три дня до рассечения тканей комара, растут C6/36 ячейки в 24-луночный планшет так, что клетка достигает 80% слияния в день, когда анализ проводится;
2. Комары анестезии при 4 ° С, жертвы и всплыли стерильной путем замачивания их в 75% этаноле в течение 1 минуты. Затем комаров промывали стерильной водой дважды, прежде чем рассечения кишки или слюнных желез при вскрытии микроскопом. С этого шага все ниже процедуру необходимо проводить в стерильных условиях, таких как биологические кабинета безопасности. Эти ткани переданы пробирку, содержащую 150 мкл СМИ и гомогенизировали с Kontes гранул пестиком двигателя в течение 90 секунд;
3. Сделать 1:100 разбавления путем добавления 10 мкл гомогената в 990 мкл средствах массовой информации;
4. Сделайте еще 1: 10, 1:100 и 1:1000 разбавления среды в 96 ячейках;
5. Удалить средств массовой информации в 24-луночный планшет, и добавьте 100 мкл каждого из этих четырех разведениях к каждому из которых соответствует хорошо;
6. Встряхните пластины медленно в течение 15 минут при комнатной температуре, затем инкубировать 45 минут при 5% СО ₂ и 37 ° С;
7. Добавить 1 мл methycellulose наложения (1%) в каждую лунку;
8. Инкубируйте пластин при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 5 дней;
9. Шагах отсюда на не требующие стерильных условиях, а как с любой другой возбудитель следует проявлять осторожность во все времена. Отменить methycellulose наложения друг от пластины и промокните, чтобы удалить излишки средства массовой информации
10. Добавить 1 мл метанола / ацетон фиксатором (1:1) в каждую лунку. Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 ч;
11. Вылейте фиксатора, и мыть один раз 1X PBS;
12. Сделать 1:1000 разбавления до первичного антитела против вируса с 5% пьяный;
13. Добавьте 200 мкл разведенной гипериммунных жидкости в каждую лунку, инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1 ч;
14. Удалить гипериммунных жидкость и промыть пластины с 1 х PBS
15. Подготовка 1:1000 разбавления антимышиного сопряжены (КПЛ Cat # 074-1806) в 5% одурманенный (5 г порошкообразного обезжиренное молоко в 100 мл 1 х PBS), а затем добавить 200 мкл в каждую лунку и инкубировать в 37 ° С в течение 1 ч;
16. Подготовка субстрата следующим образом: добавить по 1 таблетке 3 'диаминобензидина terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) в 20 мл 1 х PBS, после растворения, а затем добавить 8 мкл 30% водорода пероксидазой
17. Добавить 200 мкл выше субстрата в каждую лунку. Дайте постоять при комнатной температуре в течение 10 минут
18. Удалите подложку и остановить реакцию добавлением 1 мл дистиллированной воды в каждую лунку
19. Слейте воду и промокните пластин высохнуть
20. Граф вирусной частицы

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инкубатор				с 5% CO2, 37oC
Конические пробирки объемом 50 ml				пластиковые
Наконечник для пипеток				для культур тканей
Автодозатор (Pipettman)
Пипетки Пастера				стеклянные, стерильные
Водяная баня				37C
Центрифуга
Парафильм
Циркуляционная водяная баня
Стеклянные мембранные дозаторы				с резиновыми трубками, подходящими к дозаторам
Стаканы для комаров
75% этанол
10% отбеливатель
Планшеты для культур тканей				планшеты на 6, 24 и 96 лунок
Чашка Петри				стеклянная
Предметные стекла
Пинцет с тонкими кончиками
PBS				1X, стерильный
Диссекционный микроскоп	Микроскоп
Клетки C6/36	клетки			Для размножения вируса
Среда для C6/36				MEM с 10% термоинактивированной FBS, 1% L-глутамина и незаменимых аминокислот и 1% (v/v) пенициллина-стрептомицина.
3’-диаминобензидин тетрагидрохлорид		Sigma-Aldrich	D5905	1 таблетка на 20 ml 1 X PBS, растворить, затем добавить 8 μl 30% перекиси водорода
30% перекись водорода
A. aegypti	Животное			комар