Протокол выделения и активации сперматиды от мужских С. Элеганс Описано здесь. Резка задний конец самца сперматиды релизов. Сперматиды могут быть активированы путем добавления протеазы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Самцы и гермафродиты представляют собой две естественные половые формы нематоды C. elegans. Амебоидные сперматозоиды вырабатываются как самцами, так и гермафродитами. На ранней стадии гаметогенеза герминативные клетки гермафродитов дифференцируются в ограниченное количество сперматозоидов — около 300 — которые хранятся в небольшом «мешочке», называемом сперматекой. Впоследствии гермафродиты непрерывно вырабатывают ооциты1. Напротив, самцы на протяжении всей взрослой жизни вырабатывают исключительно сперматозоиды. Самцы производят столько сперматозоидов, что они составляют >50% от общего числа клеток в типичном взрослом черве2. Таким образом, изолировать сперматозоиды из самцов проще, чем из гермафродитов.
Лишь небольшая доля самцов образуется естественным путем вследствие спонтанного нерасхождения X-хромосомы3. Скрещивание гермафродитов с самцами или, что более удобно, введение мутаций, вызывающих фенотип Him (High Incidence of Males — высокая частота появления самцов), являются одними из способов обогащения популяции самцами3.
Самцов можно легко отличить от гермафродитов по морфологии хвоста4. Хвост гермафродита заострен, в то время как хвост самца закруглен и имеет структуры для спаривания.
Отрезание хвоста приводит к высвобождению огромного количества сперматид, хранящихся в репродуктивном тракте самца. Диссекция проводится под стереомикроскопом с использованием игл 27-го калибра. Поскольку сперматиды не связаны физически с другими клетками, гидравлическое давление выталкивает внутреннее содержимое тела самца, включая сперматиды2.
Самцов вскрывают непосредственно в небольшой капле «среды для сперматозоидов» (Sperm Medium). Сперматиды чувствительны к изменению pH. Поэтому в средах для сперматозоидов используется HEPES — соединение с хорошей буферной емкостью. Глюкоза и другие соли в составе среды поддерживают осмотическое давление для сохранения целостности сперматозоидов.
Постмейотическая дифференцировка сперматид в сперматозоиды называется спермиогенезом или активацией сперматозоидов. Шейкс5 и Нельсон6 ранее показали, что круглые сперматиды можно индуцировать к дифференцировке в сперматозоиды путем добавления различных активирующих соединений, включая Pronase E. В данной работе мы демонстрируем in vitro спермиогенез сперматид C. elegans с использованием Pronase E.
Успешный спермиогенез является необходимым условием фертильности, поэтому мутанты с дефектами спермиогенеза стерильны. До настоящего времени было показано, что ряд мутантов имеют дефекты конкретно в процессе спермиогенеза7. Обнаружение отклонений при активации новых мутантов Spe (Spermatogenesis defective) in vitro поможет нам выявить дополнительные факторы, участвующие в этом процессе.
Протокол
1) Обогащение мужского населения
- В зависимости от экспериментальной необходимо большое число мужчин может быть получена путем использования одного из следующих стратегий:
- большой популяции диких мужчин типа может быть получен путем скрещивания дикой 5 мужчин и 1 типа гермафродит на небольшой лужайке OP50 посеян в центре пластины NGM. Примерно 50% последующее поколение будет диких мужчин типа.
- его-5 (e1490), либо его-8 (e1489) гермафродиты выбросить большое количество мужчин. ним-5 и его-8 самцов плодородная и нет очевидных дефектов в морфологии сперматозоидов и функции. Таким образом, ему-5 или ему-8 самцов можно использовать вместо дикого мужчины типа для многих экспериментах.
2) выявление и изоляция мужчин
- Изучить хвост морфологии червей, хвост мужчина червя округляется.
- Выберите L4 мужчин сцене и передавать их на пластины NGM отобранный с Е. кишечной OP50, и пусть они растут в течение дня или двух. Рост безбрачия мужчин в отсутствие гермафродитов предотвратить потерю спермы и, таким образом большое количество сперматиды будут доступны во время эксперимента.
- В день вскрытия, передача безбрачия мужчин на NGM пластины без бактерий и позволить им ползать в течение нескольких минут. Этот шаг помогает снять небольшой слой E. кишечной придерживался на поверхность червей. Кроме того, пипетки небольшой объем буфера M9 (6 г Na 2 HPO 4, 3 г KH 2 PO 4, 5 г NaCl, 0,25 г MgSO 4 .7 H 2 O на литр) в часовое стекло и передача мужчин в буфер.
3) Препарирование мужчин и в активации пробирке
- Возьмите предметное стекло и отметьте небольшой круг, используя пап пера. Внесите 30-50 мкл 1X Средний сперматозоидов (50 мМ HEPES, 25 мМ KCl, 45 мм NaCl, 1 мМ MgSO 4, 5 мМ CaCl 2, 10 мМ глюкозы, рН 7,8) в пределах круга. Гидрофобные круг помогает сохранить сперму среду в пределах его границ.
- Передача 5-10 мужчин на сперму среды.
- Просмотр слайдов под микроскопом, удерживая два шприца с приложением 27 иглы на обеих руках.
- Используйте одну иглу 'держать' червя и использовать другие иглы, чтобы сократить заднем конце мужчин выпустить сперматиды.
- Резка червь обычно изгоняет огромного количества сперматид мгновенно. Сперматиды видны как минуту "гранулы" под стерео микроскопом. Однако, иногда часть или большинство сперматиды могут быть сохранены в туши. В этом случае, мягко "перетаскивания" туша за стекло может способствовать освобождению сперматиды от туши.
- Для активации сперматид, рассекать червей в 1X Средний спермы содержащие проназы Е (20μg/ml), и пусть они сидят в течение 5 минут.
- Не позволяйте слайды становятся сухими в любой момент времени эксперимента. Добавить еще 1X спермы среднего, если необходимо.
4) Визуализация spermtids и сперматозоиды
- Аккуратно покровное на поверхности расчлененный образца.
- Найти области сперматиды при малом увеличении (10х)
- Мелкие детали сперматиды или сперматозоиды можно наблюдать при переходе на большем увеличении - как правило, на 100X иммерсионного масла.
5) представитель Результаты
Примером DIC образ сперматиды изолированы от мужчин C. Элеганс показано на рисунке 1. Сперматиды имеют сферическую форму и ядер занимают видное место. В пробирке сперматозоиды активированный показаны на рисунке 2.
Рисунок 1. DIC образ C. Элеганс сперматиды.
Рисунок 2. DIC изображение в пробирке активированный C. Элеганс сперматозоидов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В дополнение к анализу Spe мутантов, этот протокол имеет и другие важные приложения, такие как анализ морфологии сперматозоидов со старением. Сперматиды и сперматозоиды выделяют, используя этот протокол можно использовать в других экспериментах вниз по течению, таких как, иммунной дикого типа и мутантных спермы 8, 9, подвижность сперматозоидов на слайдах 10, физиологических измерений 9, 11, или даже искусственное оплодотворение 12.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим Сэмюэл Уорд, Диана С. Вибрация и Грегори Нельсона за пионерский этой техники. Мы благодарим Pavan Kadandale и Брайан Geldziler для видеозаписи активированный сперматозоидов, члены лаборатории Singson за полезные обсуждения, CGC для штаммов и NIH за поддержку посредством гранта (R01HD054681).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Туберкулиновый шприц | BD Biosciences | 309623 | Шприц: 1 ml, игла: 27G X ½ in |
| Маркер Pap pen | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| Предметные стекла для микроскопа VWR VistaVision HistoBond | VWR international | 16004-406 | Размер: 75X25X1mm |
| Покровное стекло | VWR international | 48366045 | |
| Протеаза | Sigma-Aldrich | P-6911 |
Ссылки
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods in Cell Biology. , Vol. 48 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
