Мониторинг Иммунные клетки торговли Флуоресцентный Прион стержни часов после внутрибрюшинного инфекции

Краткое содержание

Здесь мы опишем новый тест для мониторинга поглощения прионов и торговли иммунными клетками сразу же после внутрибрюшинного прививки, очищая и флуоресцентно маркировки агрегированных стержней прионов из инфицированного материала мозг, то контроль за их поглощения и движение от места инъекции и характеризующие клетки посредническую этих событий.

Аннотация

Наличие ненормальной форме хост в кодировке прионных белков (PrPC), которые устойчивы протеазы, патологических и инфекционных характеризует прионных заболеваний, таких как хроническая изнуряющая болезнь (УХО) в cervids и скрепи у овец. Прионы гипотеза утверждает, что это ненормальное конформера составляет большую часть или все инфекционных прионов. Роль иммунной системы в ранние события в периферийных патогенеза прионных было убедительно продемонстрировано УХО и скрепи ^1-3. Трансгенные и фармакологические исследования на мышах показали важную роль системы комплемента в сохранении и репликация прионов в ранние сроки после инфекции ^4-6. В пробирке и в естественных исследованиях также наблюдается прионных удержания дендритные клетки ^7-10, хотя их роль в торговле остается неясно ^11-16. Макрофаги подобным же образом были замешаны в начале патогенеза прионных, но эти исследования были сосредоточены на событиях, происходящих недель после заражения ^3,11,17. Эти предыдущие исследования, также страдают от проблемы различия между эндогенными PrP ^C и инфекционные прионы. Здесь мы опишем полуколичественного, непредвзятый подход для оценки поглощения прионов и торговли от прививки сайт иммунными клетками работу там. Агрегированные стержней прионов были очищены от инфицированных гомогената мозга моющее средство солюбилизации неагрегированном белков и ультрацентрифугирования через сахарозы подушке. Полиакриламидном геле, Кумасси синим окрашиванием и западных промокательной подтвердил восстановления обогащенного прионных стержней в гранулированной фракции. Прионы стержни флуорохромом меченных затем вводили внутрибрюшинно мышам. Через два часа иммунных клеток из перитонеального лаважа жидкости, селезенки и средостения и брыжеечные лимфатические узлы были исследованы на прион удержания стержня и клеточных подмножеств, определенных многоцветной проточной цитометрии с использованием маркеров для моноцитов, нейтрофилов, дендритные клетки, макрофаги и В и Т-клеток. Этот анализ позволяет впервые прямой мониторинг иммунных клеток приобретения и торговли прионов в естественных условиях в течение нескольких часов после заражения. Этот анализ также четко различает инфекционных, агрегированные прионы из PrPC обычно выражается на клетки-хозяина, который может быть сложным и привести к интерпретации данных проблем в других системах анализа. Этот протокол может быть адаптирован для других маршрутов прививки (устный, внутривенно, intranervous и подкожно, например) и антигенов (сопряженных бусы, бактериальных, вирусных и паразитарных патогенов и белки, яйцо), а также.

Протокол

1. Очищающий и маркировки Прион стержни

Этот протокол адаптирован от одного ранее опубликованной ¹⁸

1. Однородный 100 граммов прион-инфицированные ткани головного мозга в 900 мл ледяной гомогенизации буфера (HB, 1X PBS содержащей 320 мМ сахарозы, 150 мМ NaCl и 4 мм ЭДТА) 1 мин при максимальной скорости в коммерческих блендере, затем 2 мин на льду. Повторите три раза.
2. Центрифуга гомогената в течение 10 мин при 3000 мкг и 4 ° C. Удалить супернатант и сохранить на льду. Повторное приостановить пеллет в 1л HB и повторите шаги с 1.1 и 1.2.
3. Бассейн супернатанты и центрифуги в течение 60 мин при 100 000 мкг, 0 ° C. Удалите супернатант.
4. Повторное приостановить гранул в 100 мл 1X Трис солевой буфер (10 мМ Трис-HCl, 0.1 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА), содержащий 2% Тритон Х-100 (TBST). Оценка концентрации белка в Брэдфорд или аналогичного анализа и настроить до 5 мг / мл в TBST. Холод на льду в течение 30 мин.
5. Центрифуга течение 30 мин при 100 000 мкг, 0 ° C. Удалите супернатант и мыть гранул 50 мл TBST затем 100 мл TBS. Повторное приостановить гранул в 100 мл 1X PBS, содержащем 1% sarcosyl и коктейль ингибиторов протеаз и движение в течение 120 мин при 37 ° C.
6. Слой образца на 900 мл 320 мМ сахарозы и центрифуги в течение 60 мин при 100 000 мкг, 10 ° C. Удалите супернатант и вновь приостановить гранул в 10 мл 2,3 M NaCl, 5% sarcosyl.
7. Разрушать ультразвуком образца 5 х 40 секунд при 70% максимальной мощности при 1 мин интервалы на льду.
8. Алиготе 1 мл образца в пробирки Эппендорф и центрифуги в течение пятнадцати минут при 13000 мкг, 4 °. Вымойте гранулы дважды TBS и хранить @ -70 ° C или сопряженных с флуорохромом в шаге 1.9.
9. Сопряженных 1 тюбик очищенной прионных стержней с использованием 1 флакон DyLight 649 флуорохромом согласно протоколу производителя.
10. Биржа DyLight маркировки буфер для PBS путем диализа или центрифугирования через фильтр столбцов. Хранить в 20 мкл аликвоты при -70 ° C вдали от света, пока готов к использованию.

2. Прививка Прион и восстановления клеток

Этот раздел включает в себя внутрибрюшинного прививки прионов и восстановления клеток от брюшины, средостения и брыжеечных лимфатических узлов и селезенки.

1. Развести флуоресцентные стержней прионных 1:50 в ФСБ непосредственно перед использованием. Scruff мыши, спинной меха шеи с большим и указательным пальцами, осторожно поверните мышь к лицу вам и сдерживать хвост с мизинец. Супинировать мыши, поднимая задние туловище над головой и держали его чуть с ног на голову.
2. Использование шприца 30G инсулина, вводят 100 мкл флуоресцентного стержней прионных 1 см латеральнее средней линии и 1-2 см впереди крестцово-подвздошных сочленений. Вставьте иглу 1 см через кожу направлено 45 ° медиально. Используйте 1:50 разбавление флуоресцентные шарики или PBS только в качестве контроля. Инкубируйте мышей для отведенное время перед проведением анализа.
3. Усыпить мышей в соответствии с утвержденными по уходу за животными и использовать комитета протоколов. Inject 10 мл ФСБ в брюшную полость, используя 12 мл шприца и иглы 25G. Осторожно туши продольно в течение одной минуты. Восстановление клеточной суспензии из брюшины, используя тот же шприц и иглу 16G в 15 мл коническую трубку и резерв на льду при вскрытии туш продолжается.
4. Влажные брюшной стороне каркаса тщательно с 70% этанола. Поднимите кожи на средней линии чуть ниже грудной клетки с щипцами и вырезать небольшой разрез через кожу с помощью ножниц. Начиная там, сделать 3-5 см в длину разрез через кожу в обоих направлениях, чтобы голова и хвост, затем два 2-см разрез от средней линии в сторону от каждого конца. Пил назад и контактный кожи выявить перитонеальные и грудной полостей. Аккуратно вырежьте через тонкие полупрозрачные мембраны, окружающие брюшины и отражают грудной клетки, чтобы выявить средостения.
5. Найти и удалить 2-4 лимфоузлов средостения, слегка спинной и с боков, прилегающих к тимус, медиально, прилегающих к брахиоцефальных артерий, вблизи брюшной стороне трахеи. Найти и удалить до шести брыжеечных лимфатических узлов, встроенных в мягкой белой ткани брыжеечных, что якоря кишечника задней брюшной стенки. Найти и удалить селезенку, длинный, темно-красный орган, расположенный как раз латеральнее средней линии и спинной в кишечник на левой стороне живота. Резервный лимфатических узлов в 1 мл RPMI 1640, на льду до вскрытия завершена.
6. Размочите и нажмите лимфатических узлов через 40 мкм сито петли на 3 мл RPMI в пластиковых чашках Петри, используя поршень в 1 мл шприца. Промойте фильтр с еще 2 мл RPMI и передачи 5 мл клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку. Полоскание чашки Петри с дополнительным 5 мл RPMI и трансфер в той же трубе. Центрифуга 5 мин при 250 мкг, отбросить супернатант, вновь приостановить осадок клеток в 1 мл FACS буфером (1х PBS, 1% бычьего сывороточного альбумина и 10 мМ ЭДТА) и трансфер в 1,5 мл трубки Эппендорф.

ove_title "> 3. сотовый окрашивания и проточной цитометрии

Ниже приведен типичный протокол окрашивания для выявления иммунных подмножествах ячейку с помощью флуоресцентных антител против хорошо изученных иммунных маркеров на клеточной поверхности. Все антитела разводили в буфер FACS непосредственно перед употреблением.

1. Граф клетки и аликвоты 10 ^{6 клеток} в пробирки Эппендорф. Центрифуга клеток (см. п. 2.7) и мыть гранул 2 раза с 1 мл буфера FACS.
2. Инкубируйте клетки 20 минут на льду в 100 мкл 2 нг / мл крысы антимышиным CD16/32 блокировать эндогенных рецепторов Fc. Гранул и промыть клетки с буфером СУИМ.
3. Добавить 100 мкл 1ng / мл соответствующие флуоресцентные antibod (у) х годов к каждому образцу и инкубировать на льду в течение одного часа. Добавить 100 мкл FACS буфера только для управления клетками. Гранул и промыть клетки дважды буфера FACS.
4. Повторное приостановить клеток в 1 мл ACK буфера (150 мМ NH ₄ Cl, 1 мМ KHCO ₃ и 0,1 мМ ЭДТА) Инкубируйте на льду в течение 1 мин для лизиса эритроцитов. Гранул и промыть клетки с буфером СУИМ. Повторное приостановить клеток в 1 мл буфера FACS.
5. Сбор данных из ячеек с помощью проточного цитометра способны многоцветной обнаружения и анализа, как правило, с 405, 488 и 633 нм возбуждения лазеров и 9:55 флуоресценции детекторов излучения.

4. Представитель Результаты:

Мы очищенной прионных стержней из сырой, прион-инфицированных гомогената головного мозга (рис. 1) растворение моющего средства и ультрацентрифугирования из Е2 лося гомогената мозга (дорожки 1 и 2) значительно обогатили для прионных стержней (сравните полосы 1 и 3), который также был протеазы К устойчивы (дорожка 4). Интересно, что непереваренные очищенные стержни прионных отображается glycoform профиля поразительно похожи на переваривается гомогената мозга Е2, что указывает на драматический обогащения для прионов. Одинаково обработанных нормальным гомогената мозга не дали PK-устойчивые PrP ^C (полосы 5 и 6).

Проточной цитометрии анализа конкретных популяций клеток показали, что антиген представляющих клеток домой брюшины на два часа и сохранить флуоресцентные бусы и прионных стержней, о чем свидетельствуют резко возросло флуоресценции по PBS вводят элементы управления (рис. 2). Нет клеток, полученных из брюшины ФСБ обработанных управления отображается флуоресценции выше фона (рис. 2A-G), тогда как клетки от борта (рис. 2H-N) и прионов (рис. 2 O-U)-прививку мышей отображается значительные флуоресценции, особенно на моноциты (рис. 2I и Р), дендритные клетки (рис. 2K и R) и макрофагов (рис. 2 л и S), а некоторые Нейтрофилы (рис. 2J и Q) и меньшее количество В-клеток (рис. 2Г). Бусы и прионных несущих моноциты, дендритные клетки и макрофаги были обнаружены и в лимфатические узлы средостения через два часа после прививки (рис. 2AD и АК, А. Ф. и А. М. и А. Г. и, соответственно), в то время мало или совсем нет PrP ^УХО несущих Нейтрофилы , В или Т-клетки были найдены (рис. 2AE и AL, AH и А. Г. и А. И. и П., соответственно). Мы не обнаружили бусы или прион стержней в селезенке или брыжеечных лимфатических узлов (данные не приведены). В целом, эти данные показывают, что иммунные клетки прионы движения очень похоже на другие антигены частиц.

РЕАГЕНТ	Флюорохром	Лазерного возбуждения (нм)	Максимум излучения (нм)
Прионы стержней	DyLight 649	633	674
1 мкм бисером	AlexaFluor 660	633	685
Антитела
CD11b	eFluor 450	405	450
	Фикоэритрин-Cy7	488	760
CD11c	R-фикоэритрин	488	575
	Фикоэритрин-Cy7	488	760
Ly6C	Fluoroisothiocyante	488	518
Ly6G	R-фикоэритрин	488	575
CD21	DyLight 488	488	518
B220	Allophycocyanin-Cy7	633	785
CD3	R-фикоэритрин	488	575

"> Таблица 1. Спектральные свойства флуоресцентных реагентов

Рисунок 1. Очистка прионных стержней из зараженных гомогената мозга. Мы использовали 10% гомогената сырой мозг от УХО-инфицированных оленей (E2, дорожки 1 и 2) в качестве исходного материала, из которого мы очищенной агрегированных стержней прион (полосы 3 и 4). Оба сырой и очищенной материалов наблюдались характерные сопротивления протеазы К лечению (дорожки 1 - 4), в то время как нормальные гомогената мозга нет (полосы 5 и 6). Молекулярные маркеры веса приведены в Kd слева от пятна. BH, гомогената мозга.

Рисунок 2. Проточной цитометрии анализа иммунных клетках торговли прионы из брюшины в лимфатические узлы средостения через два часа после прививки. PBS (панели AG и V-AB), флуоресцентные шарики (HN и AC-AI) или Прион стержней (OU и AJ-AP) были вводится в брюшину мышей и клеток, полученных из перитонеального лаважа жидкости (АС) или лимфатические узлы средостения (V-AP), через два часа. Графики в первой колонке показывают клетки мышей, получавших PBS (панели и V), флуоресцентные шарики (панель H и переменного тока) и прионных стержней (панели вывода и AJ). Флуоресцентные клеток (красные или зеленые точки) и общего числа клеток (серых точек) приведены, чтобы показать относительный размер (вперед разброс), детализации (боковой разброс) и доля от общего числа живых клеток, которые светятся. Значительное число клеток, характерных гранулоцитов сохранена флуоресцентные бусы и стержней. Клетки также окрашивали антителами против иммунных клеток поверхностных маркеров и закрытого для LyG-Ly6C + моноцитов (панели В, I, P, W, А. Д. и А. К.), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + нейтрофилов (C, J, Q, X, А. Е. А. Л.), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + дендритных клеток (D, К, Р, У, Ф. и А. М.), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + макрофаги, (E, L, S, Z, А. Г. и), CD3 -B220 + CD21 + B-клеток (F, M, T, AA, AH и АО) и CD21-B220-CD3 + Т-клеток (G, N, U, А. Б., А. И. и П.). Моноциты, дендритные клетки и макрофаги сохранил флуоресцентные бусы и прионных стержней в брюшной полости (панели я и P, K и R и L и S, соответственно) и перевезли их в лимфатические узлы средостения (панели AD и АК, А. Ф. и А. М. и А. Г. и, соответственно), демонстрируя подобный поглощения и оборота этих двух частиц. Нейтрофилы сохранил значительное количество шариков (J) и меньшее количество стержней (Q), но не смогли доставить их в лимфатические узлы (А. Е. и А. Л.). В-клетки сохраняются и транспортируются некоторые стержни (Т и АО), но практически не бусин (М и АГ). Т-клетки торговли ни бисером, ни стержни (N, U, А. И. и П.).

Обсуждение

Здесь показано, протокол для маркировки и отслеживания прионов в естественных условиях, что значительно облегчает мониторинг ранних событий в периферической инфекции прион. Этот протокол значительно повышает на прошлых попытках мониторинга поглощения прионов в пробирке ⁹ и в естественных условиях ^3,12 по предварительной маркировке обогащенного прионных посевной однозначно отличить его от эндогенных PrP ^C. Потому что инфекционные прионы и PrP ^C одни и...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мозг лося, инфицированный CWD	Частная ферма лосей в Колорадо		Используйте любой мозг, инфицированный прионами нечеловеческого происхождения
Блендер	Oster Professional Products	6694-015	Используйте любой коммерческий блендер
Центрифуга	Sorvall, Thermo Scientific	ротор SS34	Используйте любую центрифугу/ротор, способные развивать ускорение 3000 x g и вмещать объемы ≥ 500 ml
Ультрацентрифуга	Beckman Coulter Inc.	ротор 50.2 Ti	Используйте любую ультрацентрифугу/ротор, способные развивать ускорение 100,000 x g и вмещать объемы ≥ 500 ml
Реагент Брэдфорд	Sigma-Aldrich	B6916
Комплектный мини-коктейль ингибиторов протеаз	Roche Group	11 836 170 001
Соникатор	Misonix	MP4000X	Используйте любой рожковый или зондовый соникатор, настроенный на ~70% максимальной мощности
Набор для мечения антител DyLight	Thermo Fisher Scientific, Inc.	53050
Микроцентрифуга	Eppendorf	55430R	Используйте любую охлаждаемую микроцентрифугу, способную достигать 13,000x g
Центрифужные фильтрующие колонки	EMD Millipore	Microcon YM-100	Используйте любой фильтр или диализную мембрану с порогом отсечки по молекулярной массе 100 Kd
Мыши FVB в возрасте 8-40 недель	Charles River Laboratories	207	Используйте любую инбредную линию мышей
Красные флуоресцентные микросферы диаметром 1 μm	Phosphorex	2307	Используйте любые флуоресцентные микросферы диаметром ≤ 10 μm
Среда RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Клеточный фильтр 40 μm	Falcon BD	352340
Флуоресцентные антитела	BD Biosciences	Различные	Используйте любые флуоресцентные антитела, подходящие для вашего применения.
Проточный цитометр	Dako	CyanADP	Используйте любой проточный цитометр, способный осуществлять многоцветную флуоресцентную детекцию