Методическая статья

Протокол по производству Генетические Креста Паразиты грызунов малярией

15K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2365

⸱

3 января 2011 г.

 ,  , 
1National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2School of Life Science, Xiamen University

В этой статье

Краткое содержание

Генетические кресты паразитов малярии грызунов проводится путем подачи двух генетически различных паразитов комаров. Рекомбинантный потомства клонированных из крови мышей после учета комары кусать зараженных мышей. Это видео показывает, как производить генетические кресты Plasmodium yoelii И применим и к другим малярийных паразитов грызунов.

Аннотация

Изменения в ответ на противомалярийных препаратов и патогенность малярийных паразитов имеет биологическую и медицинскую значимость. Связь отображение привело к успешной идентификации генов или локусов лежащий в основе различные черты в малярийных паразитов грызунов и человека 1-3 4-6. Малярийного паразита Plasmodium yoelii является одним из многих видов малярии, изолированных от диких африканских грызунов и была адаптирована для роста в лабораториях. Этот вид воспроизводит многие биологические характеристики человека малярийных паразитов; генетических маркеров, таких как микроспутник и усиливаются полиморфизма длины фрагмента (AFLP) маркеры были также разработаны для паразита 7-9. Таким образом, генетические исследования возбудителя малярии грызунов могут быть выполнены в дополнение к исследованиям на Plasmodium тропической. Здесь мы демонстрируем методы получения генетического крест в P. yoelii, что впервые были пионерами докторами. Дэвид Walliker, Ричард Картер, и его коллеги из Эдинбургского университета 10.

Генетические крестов в P. yoelii и других паразитов малярии грызунов проводятся путем заражения мышей Mus мышцы с посевной содержащие гаметоциты двух генетически различных клонов, отличающихся фенотипов интереса и позволяя комаров кормить на зараженных мышей через 4 дня после инфицирования. Наличие мужского и женского гаметоциты в кровь мыши микроскопически подтверждено перед кормлением. В течение 48 часов после кормления, в средней кишке комаров, гаплоидный гаметоциты дифференцироваться в мужской и женской гамет, удобрять и образуют диплоидные зиготы (рис. 1). Во время развития зиготы в ookinete, мейоз появляется происходить 11. Если зиготы происходит через перекрестное опыление между гаметы из двух генетически различных паразитов, генетический обмен (хромосомная рекомбинации и кроссоверов между не-сестринских хроматид из пары гомологичных хромосом;. Рис. 2) может иметь место, в результате рекомбинации генетического материала на гомологичных локусов. Каждая зигота претерпевает два последовательных делений ядра, что приводит к четыре гаплоидных ядер. Ookinete дальнейшем перерастает в ооцисты. После ооцисты созревает, тысячи спорозоитов (потомство крест) формируются и выпущены в hemoceal комара. Спорозоиты собирают из слюнных желез и вводят новые мышиные хозяин, где пре-эритроцитарных и эритроцитарных этапе развития имеет место. Эритроцитарных форм клонируются и классифицируются исходя из отличительных символов родительских линий до генетического картирования связи. Управление инфекций индивидуальных родительских клонов выполняются таким же образом, как производство генетической крест.

Протокол

Асептический методы должны применяться ко всем материалам, которые будут администрируемых в животных, чтобы избежать случайного введения экзогенных инфекционных агентов в организм мышей, которые можно смешивать экспериментальных результатов.

1. Заражение лабораторных мышей с кровью стадии малярийных паразитов

  1. При комнатной температуре таяния флаконах, содержащих по два замороженных паразитов этапе крови малярии должны быть скрещены. В этом примере два грызуна штаммы малярийного паразита Plasmodium используются yoelii yoelii и Plasmodium yoelii nigeriensis.
  2. Fit шприц с 22-30 колеи (G) иглы и составить 400 мкл стерильной, фармацевтического класса PBS (рН 7,4).
  3. Используя тот же шприц, составляет 100 мкл талой инфицированной крови; инвертировать шприцем вверх и вниз, пока содержание однородно смешанные. (Дополнительно: пипетка может быть использована для передачи PBS и инфицированная кровь в пробирку, до перевода в шприц для инъекций).
  4. Inject 200 мкл раствора, содержащего паразита непосредственно в брюшной полости мыши. Когда закончите, удалите шприц в мусорном ведре острых предметов. (См. также дополнительные материалы для обеспечения лабораторных мышей). В общем, стандартный размер посевной между 100-500 мкл, в зависимости от уровня паразитных инфекций в оригинальном замороженных материалов.
  5. Inject два паразита штаммов для пересекли границу двух мышей в каждой. Мыши станет положительным микроскопически от 3 до 5 дней после инъекции. Когда parasitemias руки между 1-5%, переходите к следующему шагу.

2. Смешанные инфекции клонов мышей

  1. До смешанной инфекции клон, собирают кровь из хвоста два донора мышей, зараженных различными штаммами паразита для микроскопического исследования по Гимза окрашенных тонких мазков крови (рис. 3), а также для измерения плотности красных клеток крови (см. дополнительные материалы для детальных процедур) .
  2. Рассчитайте объем физиологического раствора (1,5% вес / тринатрия цитрат, 0,85% вес / хлорид натрия) и мышь крови, необходимых для производства посевной смеси с использованием паразитемии и красных кровяных телец измерения плотности, полученной ранее.
  3. Отрегулируйте паразита решение конечной концентрации одного миллиона инфицированных эритроцитов в 100 мкл.
  4. Комбинат инфицированной крови от двух доноров в соотношении 1:1 для получения смешанного клон посевной. Когда два родительских клонов различаются по скорости роста, регулировать пропорции быстрорастущих родительской к медленно развивающихся родительских клонов до 1:2 или 1:5.
  5. Inject 100 мкл смешанного образца в брюшину каждой мыши, чтобы быть инфицированы. (См. также шагом 3,9, чтобы определить количество мышей для инъекций)
  6. Используя этот метод, заразить две мыши каждый с одним родительских штаммов. Одно-клон инфекции позволит определение об успешной отправке двух родительских штаммов.

3. Кормление Комары

  1. Подготовка три клетки содержащие 300-500 взрослых (мужчины и женщины) Anopheles stephensi комаров каждый, возраст 5-7 дней после выхода из куколки. Контейнеры покрыты сеткой безопасности по пластиковой или металлической крышкой. Два Клетки для кормления по уходу за ребенком клонов, третья клетка для подготовки генетического крест.
  2. Начиная через четыре дня после смешанного клон инфекции, подготовить Гимза окрашенных мазках тонкий хвост крови от зараженных мышей.
  3. Изучение мазков под микроскопом путем сканирования не менее 50 микроскопических полей на увеличение 1000x и определить, насколько мужчина и женщина гаметоциты присутствуют.
  4. Мужские и женские гаметоциты узнаваемы благодаря наличию больших вакуолей и крупные гранулы (рис. 3). Мужские и женские гаметоциты имеют розовый и голубой цитоплазмы, соответственно. Если гаметоциты присутствуют, следуйте шагу 3.6.
  5. Если гаметоциты отсутствуют, держать мониторинг в день, пока они появляются. Если гаметоциты присутствуют, продолжить следующий шаг.
  6. Inject 50 мкл анестезии препарат коктейлем, содержащим 33 мг / мл кетамина и 3 мг / мл ксилазина в брюшины мыши обезболить каждого инфицированного мыши (за 20 грамм массы тела мыши). Заключительные дозу кетамина и ксилазина это 82,5 и 7,5 мг / кг, соответственно.
  7. Место мышей лицом вниз на верхней части клетки содержащие взрослых комаров Anopheles stephensi, которые голодали сахара поставки в течение 24 часов и позволить комаров кормить в течение 30 минут без перерыва.
  8. Поддерживать комаров в insectary в стандартных условиях (температура поддерживается между 24-26 ° C, см. также дополнительные методы для обеспечения лаборатории комаров).
  9. Используйте один зараженный мыши для каждого 50-100 самок комаров. Усыпить мышей сразу шейки дислокации после кормления в то время как мыши все еще под наркозом.

4. Пройдя Mosquito MidgОТС и подсчет ооцист

  1. Через девять дней после кормления, комары будут рассмотрены на ооцист в средней кишки насекомого. Наличие ооцист в комаров, которые питаются одним клоном инфицированных мышей показывает, что гаметоциты из двух родительских штаммов являются инфекционные.
  2. Чтобы вскрыть комара кишки, используйте аспиратор подключен к небольшой контейнер для сбора от 5 до 10 инфицированных комаров из клетки.
  3. Использование CO 2 газ, обезболить комаров и передачи их в стеклянной посуде Петри на льду. Отдельный и отбросить мужской комаров. Антенны самцов заметно bushier по сравнению с самками.
  4. Заполните два шприца с PBS и вписать их в 26 калибр полдюйма (G ½) иглы. Депозит около 100 мкл PBS из шприца на предметное стекло.
  5. Передача от 5 до 10 наркозом самок комаров на каплю PBS и место скользить по рассекает микроскопом.
  6. Используя те же иглы, удалить крылья каждого комара и ноги, затем, держа насекомых в брюшной полости грудной клетки и задней, вытащить тело на части, пока кишки, белый мешок типа тела, не будет отпущена. Отсоедините кишки и отбросить остальные части тела.
  7. Добавить еще PBS на средней кишки, если слайды сухие. Средняя кишка будет вырожденной, если позволяют высушить. Место крышка скользить по midguts.
  8. Изучить midguts под световым микроскопом при увеличении 100х. Граф количество ооцист в каждой средней кишки (рис. 3). Ооцисты узнаваем как толстостенных кольцевые структуры, которые лежат на внешней поверхности midguts.
  9. Когда закончите, распоряжаться шприцы, иглы и слайд бен острых предметов.
  10. Если ооцисты отсутствуют в midguts, кормить комаров с зараженных мышей с большим числом гаметоциты и дать больше время кормления. Температура имеет решающее значение для этого шага. Убедитесь, что температура установлена ​​на уровне от 24 до 26 ° C.

5. Сбор Спорозоиты от комаров с помощью центрифугирования

  1. Подготовка спорозоита труб коллекцию следующим образом: вырезать крышку чистой 0,5-мл центрифужную пробирку и пробить отверстие (0,1-0,2 мм в диаметре) в нижней части трубки использованием пылали 19 G иглу.
  2. Заполните 1 / 3 от трубка со стеклянной ваты. Вставьте фильтр трубки в 1,5-мл пробирки (одна труба достаточно урожая спорозоитов от ~ 100 комаров)
  3. На 17-й день после кормления, собирают комаров (Шаг 4) из клетки в небольшом контейнере с помощью аспиратора.
  4. Использование CO 2 газ обезболить комаров.
  5. Отдельные женщины из мужской комаров. Передача под наркозом самок комаров из контейнера на стеклянном блюде Петри на льду.
  6. Приготовьте два шприца с 26 G ½ игл заполнены PBS. Депозит около 100 мкл PBS из шприца на предметное стекло.
  7. Передача комаров на предметное стекло. Удалить комаров головы, крыльев, ног и живота при вскрытии микроскопом.
  8. Использование с острым концом щипцов передачи thoraxes в 0,5 мл PBS в 1,5-мл гомогенизатора (ступку и пестик). Магазин thoraxes на льду (спорозоита остается инфекционным в течение 2-3 ч).
  9. Однородный thoraxes на лед, чтобы освободить от спорозоитов слюнных желез (см. Рисунок 3), и передача лизаты (гомогенатах) в трубки, заполненной стекловатой (шаг 5.1-5.2) с использованием стеклянной пипетки.
  10. Центрифуга от 10 до 20 сек при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре.
  11. Сбор проточные (суспензия очищенного спорозоита), используя шприц с иглой 22-30 G. (Дополнительно: падение 10-50 мкл проточные на микроскопический слайд, место покровное стекло и визуализации живых спорозоитов под стандартный световой микроскоп, 400X увеличение, см. также рис 3)
  12. Inject ф 0,1-0,5 мл суспензии в спорозоита мышей (до 200,000 паразиты могут быть собраны из одного комара; см. ссылку 12). В случае успеха, животные будут инфицированы 72 часов после инъекции.

6. Клонирование Потомство использованием ограниченной Разбавление

  1. Семьдесят два часа после инъекции спорозоита, собирают кровь из хвоста два донора мышей, зараженных различными штаммами паразита для микроскопического исследования после Гимза окрашивания тонких мазков крови и для измерения плотности красных клеток крови (см. дополнительные материалы для детальных процедур).
  2. Выберите мышью отображения 0,1 до 1% паразитемии и чьи инфицированные эритроциты содержат в основном одно паразитов в качестве донора для клонирования. Повторите шаг 6,1 ближайшие дни, если мышей микроскопически отрицательным. Если животные не заражены в течение 14 дней, повторите шаг 2 до 5 и определить наличие спорозоитов в шаге 5.11).
  3. Развести собрано хвост крови в холодной 1:01 Решение Решение телячьей сыворотки и млекопитающих Рингера (2,7 мМ хлористого калия, 1,8 мМ хлорида кальция, 154 мМ хлорида натрия), чтобы достичь конконцентрации от 0,6 до 1-инфицированных эритроцитов на 100 мкл, и хранить посевной на льду. Таким образом, большинство индивидуальных мыши должны получить один или нулевой паразитов.
  4. Внутривенно вводят по 100 мкл разбавленного инфицированной крови в каждой от 50 до 100 мышей.
  5. Через пять-семь дней спустя, экран мышей на наличие паразитов крови стадии рассмотрения Гимза окрашенных тонких мазков крови. В успешный эксперимент, 20-50% мышей заразиться и покажет паразитемии в 0,1-5,0% в 8-й день после заражения.

7. Характеристика Потомство использованием генетических маркеров

  1. Соберите 20 до 40 мкл крови мышей хвост в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку, содержащую 0,2 мл охлажденного физиологического солевого раствора цитрата, вихревые кратко, а центрифуги в течение 3 мин при 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре до гранул кровяных клеток. Извлечение ДНК сразу или хранить гранулы при температуре -80 ° C.
  2. Подготовка паразита ДНК, используя любые стандартные методы выделения ДНК. Для быстрого изолирования ДНК, использование особо чистых шаблон ПЦР подготовка комплекта (Рош Прикладные Bioscience).
  3. Рекомбинантный потомства определены после генотипирования использованием микроспутников (МС) или одиночных нуклеотидных полиморфизма (SNP) на разных хромосомах, которые могут дифференцироваться два родительских штаммов генетическая крест. Упрощенный метод с использованием одного флуоресцентного меченных праймеров для MS генотипирования П. yoelii могут быть использованы (см. 8,9).

8. Криоконсервация крови стадии малярийных паразитов

  1. Сбор 0,5-1 мл инфицированной крови пункции сердца с наркозом мышь с паразитемии 5-20% в 5-10 мл охлажденного физиологического раствора.
  2. Центрифуга в течение 5 мин при 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Удалите супернатант.
  3. По каплям добавить 2x Объем Glycerolyte 57 решения (Fenwal Laboratories) на крови гранул и хорошо перемешать.
  4. Передача подвески cryotubes (0,2-0,5 мл на трубку).
  5. Магазин криоконсервированных крови при температуре -80 ° С (до 1 месяца) или в жидком азоте.

9. Представитель Результаты:

В успешный эксперимент, 5-10% от клонированных линий будет независимым рекомбинантный потомства.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение жизненного цикла и генетической рекомбинации событий во время генетические крест. Генетическая рекомбинация события происходят на ранней стадии развития в организме комара. После оплодотворения "гаплоидных" мужской и женской гамет различных генетических опытом работы в средней кишке комара ", диплоидные" зиготы формируются. Зигота представляет собой лишь этап диплоидных жизненного цикла паразита; мейоза следует в течение 12 часов оплодотворения, и все последующие этапы комаров и млекопитающие остаются гаплоидными. В результате зиготы развиваются в ookinetes и ооцисты. Рост и митотического деления каждого ооцисты производит тысячи спорозоитов, которые высвобождаются в hemoceal комаров. Те, спорозоиты, что переход на слюнные железы находятся в состоянии быть переданы млекопитающего, где развитие печени и красные клетки крови этапах происходит. В ходе красный циклы клеток крови, некоторые паразиты могут дифференцироваться в зрелые мужские и женские гаметоциты. Цикл паразита жизнь заканчивается, когда эти гаметоциты принимаются к другой комар, увековечивая передачи.

Рисунок 2
Рисунок 2. Наследование ядерных генов в малярийных паразитов и производстве рекомбинантных потомства. Генетическая рекомбинация может быть собрана хромосомных рекомбинации или кроссовер событий. Гомозиготные потомства производства самоопыления между гамет одного и того же родительского клона 1 или 2 (и D), соответственно. Б) Гетерозиготные потомства производства взаимообогащения гаметы двух различных родительских клонов, рекомбинантный ядер (синий овал) формируется путем хромосомного рекомбинации в одиночку. С) Гетерозиготные потомство производится из взаимообогащения гаметы двух различных клонов родителей, рекомбинантный ядер (красный овал) формируется путем пересечения между не-сестринских хроматид гомологичных хромосом.

Рисунок 3
Рисунок 3. Морфология грызунов малярийного паразита Plasmodium yoelii. ) Кольцо этапе, В) трофозоит, С) шизонта, D) мерозоиты, Е) незрелые мужчины гаметоцит, F) зрелых мужчин гаметоцит, G) незрелых женщин гаметоцит, H) взрослая самка гаметоцит, I) кишки с ооцист на 10 день после кормления (зрелых ооцист указаны стрелками; 200x увеличение), J) слюнные железы комара (100x увеличение), К) спорозоитов (400x увеличение).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы демонстрируем методы для производства генетических крест грызунов малярии Plasmodium yoelii, которое также применимо к производству генетического кресты и в других малярии грызунов. Инфекции мышей с одной родительской клоны, как правило, проводится для определения успешной передачи родительских паразитов, чтобы родители компетентных в производстве функциональных гамет перед выполнением крест.

Успешная передача через комара зависит от нескольких факторов, включая температуру insec...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Потому что авторы являются правительственными служащими, и это государственная работа, работа находится в общественном достоянии в США. Независимо от других соглашений, NIH оставляет за собой право на предоставление работы PubMedCentral для отображения и использования общественных и PubMedCentral могут теги или модифицировать его в соответствии со своей обычной практики. Вы можете установить права вне субъекта США в лицензии на использование правительством.

Благодарности

Мы благодарим доктора Рэнди Элкинс, Робин Kastenmayer, Тед Торри, Дэн Паре и Tovi Lehman за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана Внутренние программы исследований Отдела Внутренние исследований, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, а также 973 Национальные программы фундаментальных исследований Китая, # 2007CB513103. Мы благодарим NIAID очной редактор Бренда Маршалл Рей об оказании помощи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ:

  • Техническое обслуживание лабораторных мышей
  • Техническое обслуживание лабораторных комаров
  • Микроскопическое исследование тонких мазков крови окрашивали Гимза
  • Измерение плотности красных клеток крови

Техническое обслуживание лабораторных мышей

Самки мышей инбредных штамм лаборатории BALB / с, в возрасте от 5 до 8 недель, которые используются в исследовании. Мыши размещены в стандартном твердого поликарбоната нижней клетке с проволокой-бар крышкой, оснащенной фидера и бутылку воды. Мыши поддерживается при постоянной температуре (25 ± 1 ° С) на 12:12 час свет: темно-цикла. Мыши могут питаться 2018S Харлан Teklad Глобальный 19% белка экструдированного диеты грызунов (стерилизация, от Харлан-Teklad) и поставляется с подкисленной питьевую воду без ограничений. Эксперименты на животных проводятся в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными уходу и использованию животных комитетом на Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний по протоколу LMVR11E (Национальный институт здоровья, Бетезда, штат Мэриленд).

Техническое обслуживание лабораторных комаров

Комары из лаборатории воспитанный колонии Anopheles stephensi. Взрослые ведутся в нейлоновых клетки хранятся в температуре и влажности контролируемой комнате (от 23 до 25 ° С для плазмодия Plasmodium yoelii и chabaudi, и 19 до 21 ° С в течение Plasmodium berghei; от 80 до 95% влажности, с 12:12 часов свет: темно-цикла). Взрослые комары питаются 10% глюкозы и 2,00% парааминобензойной кислотой (ПАБК) дополнить водного раствора. Для получения высококачественных взрослых, 500 личинок, выращенных в низкой плотности состояние в 1 л дистиллированной воды в 1000 см 3 открытых блюда поставляются с примерно 1 мг натрия бикарбоната. После вылупления личинок приведены TetraMin порошка (PETCO), пока они не перерастают в стадии куколки и передаются в клетках взрослого комара для развивающихся.

Микроскопическое исследование тонких мазков крови окрашивали Гимза

Использование чистых ножницами отрезать кончик (1,0 мм), хвоста инфицированные мыши. Поместите одну каплю (0,5-1,0 мкл) хвоста кровь на чистую слайд образца. Мышь будет остановить кровотечение в течение 1-2 мин. Место чистое слайд разбрасыватель на вершине капли крови, поддержание его на угол 45 ° по отношению к образцу слайдов, и позволяют крови адсорбироваться на всю ширину шпателя. Держите образец слайдов и продвигать разбрасыватель слайд быстро и плавно производить тонкий мазок. Пусть кровь фильм сухой, а затем погружают слайды в абсолютном метаноле. Разрешить слайд высохнуть на воздухе еще раз перед покрывая ее Гимза (10% Гимза красителя в дистиллированной воде). После инкубации тонких пленок крови в течение 10-15 минут при комнатной температуре, тщательно промойте слайды с водопроводной водой и дайте ему высохнуть на воздухе. Проверьте количество зараженных эритроцитов (iRBC, см. рисунок 3 для морфологии зараженных РБК) под световым микроскопом с погружением нефть на увеличение 1000x (с объективом 100х) и вычислим паразитемии (количество iRBC на 100 РБК в счет). Различные штаммы малярийных паразитов различаются по скорости роста и патогенности. Мониторинг parasitaemias крови этап может быть выполнен за 24 часа после инъекции, в зависимости от дозы крови паразиты стадии малярии. Например, мыши будет положительным микроскопически 24 часов при введении с 10 7 инфицированных РБК внутрибрюшинно или 10 6 инфицированных РБК внутривенно.

Измерение плотности красных клеток крови

Как уровни parasitaemias, красных кровяных клеток (эритроцитов) плотности в зараженных мышей изменяется в течение всего инфекция. РБК плотности следует измерять в течение 1-2 часов до начала одно-и смешанных инфекций и клон клонирование экспериментов. Есть два метода для измерения плотности РБК: ручного подсчета использованием Нойбауэр гемоцитометра и автоматического подсчета использованием Cellometer (Nexcelom Bioscience). В обоих методах, снять 1 мкл мыши хвост крови с помощью стеклянного капилляра (VWR) и разбавить в 10 мл PBS и хорошо перемешать. Для использования гемоцитометра Нойбауэр, нагрузка 20 мкл суспензии на hemacytometer. Место hemacytometer на световой микроскоп с 10-кратным объективом. Hemacytometer содержит сетки разделена на 9 больших площадях, и 4 больших площадей на углу свою очередь делятся на 16 маленьких квадратов. Подсчитать общее число ячеек в каждой из 16 малых квадратов в четыре квадрата угла. Чтобы избежать предвзятости или подсчет подсчетом клетки, которые накладываются линии сетки, граф клетки как "в", перекрывает ли он сверху или правой линии и "вне", перекрывает ли он вниз или слева линий. Оцените число клеток на один маленький квадрат и разделить на 0,00625 (объем одной небольшой площади 6,25 NL). Это дает число клеток на микролитр (&му, L). Исходя из этих данных, вычислить окончательный красный плотность кровяных клеток путем умножения на 10 тысяч (коэффициент разбавления). Промыть скольжения крышкой и счетной камеры с дистиллированной водой и 70% этилового спирта; высохнуть на воздухе. Кроме того, нагрузка 20 мкл суспензии на камеру слайд подсчета Cellometer. Вставьте слайд в Cellometer камере слайд (читателя). Начало Cellometer программного обеспечения, выберите "красных клеток крови" вариант, и введите коэффициент разбавления 10000. Запись плотности РБК.

Ссылки

  1. Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).
  2. Cravo, P. V. Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).
  3. Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved? Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).
  4. Yuan, J. Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum. Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).
  5. Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa. Cell. 91, 593-603 (1997).
  6. Hayton, K. Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion. Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).
  7. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite. Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).
  8. Li, J. Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites. Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).
  9. Li, J. Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method. Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).
  10. Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. Genetic recombination in malaria parasites. Nature. 232, 561-562 (1971).
  11. Sinden, R. E., Hartley, R. H. Identification of the meiotic division of malarial parasites. J Protozool. 32, 742-744 (1985).
  12. Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. J Parasitol. 70, 831-833 (1984).
  13. Yoeli, M., Most, H., Bone, G. Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus. Science. 144, 1580-1581 (1964).
  14. Landau, I., Boulard, Y. Life cycles and Morphology. , Academic Press. London/New York/San Franciso. (1978).
  15. Vanderbergh, J. P. Y., M, Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. J Parasitol. 52, 559-564 (1966).
  16. Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami. Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).
  17. Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. ene encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).
  18. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria. PLoS One. 2, e857-e857 (2007).
  19. Mackinnon, M. J., Read, A. F. Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi. Evolution. 53, 689-703 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Plasmodium yoelii

Похожие статьи