Количественная оценка амилоидов, индуцированных бактериальной инфекцией, с помощью флуоресценции тиофлавина Т

Аннотация

Источник: Balczon, R., et al. Методы обнаружения цитотоксических амилоидов после инфицирования эндотелиальных клеток легких Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется протокол количественного определения амилоидов в надосадочной жидкости культур из эндотелиальных клеток легких, инфицированных вирулентными бактериями, с использованием тиофлавина Т, флуоресцентного красителя, который связывается со структурами бета-листьев амилоида. Увеличение флуоресценции по сравнению с исходным уровнем указывает на присутствие амилоидов в надосадочной жидкости культуры.

Протокол

1. Анализ цитотоксических надосадочных пластов

1. Чтобы провести анализ на тиофлавин T (ThT), используйте флуоресценцию ThT для количественного определения амилоидов в надосадочной жидкости. Для этих измерений используйте стерилизованные фильтром надосадочные потоки.
   1. Приготовьте стоковый раствор (50x) ThT, суспендировав 8 мг ThT в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). После смешивания отфильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм для удаления твердых частиц.
   2. Для измерений добавьте 20 мкл запаса ThT к 1 мл PBS в кювете спектрофотометра объемом 1 мл. Поместите разведенный образец в спектрофлуориметр.
   3. Измерьте базовое флуоресцентное излучение с помощью возбуждения 425 нм и сканирования флуоресцентного излучения от 450-575 нм с шагом 2 нм.
   4. Выполните интервальное сканирование с использованием возбуждения 425 нм и излучения 482 нм, данные собираются каждые 0,2 с в течение 60 с.
   5. В течение первых 20 секунд интервальной съемки измеряется флуоресценция в заготовке кюветы. Через 20 с поставьте сканирование на паузу и добавьте в кювету 10 мкл стерилизованной фильтром надосадочной жидкости. Перемешайте кювету путем инверсии, а затем поместите ее обратно в спектрофлуориметр.
   6. Возобновите сканирование по времени, получив последние 40 секунд данных.
   7. По завершении интервального сканирования выполните окончательное сканирование спектра флуоресцентного излучения с теми же настройками, как описано в шаге 1.3.

Материалы