Количественная оценка амилоидов, индуцированных бактериальной инфекцией, с помощью флуоресценции тиофлавина Т

Аннотация

Источник: Balczon, R., et al. Методы обнаружения цитотоксических амилоидов после инфицирования эндотелиальных клеток легких Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется протокол количественного определения амилоидов в надосадочной жидкости культур из эндотелиальных клеток легких, инфицированных вирулентными бактериями, с использованием тиофлавина Т, флуоресцентного красителя, который связывается со структурами бета-листьев амилоида. Увеличение флуоресценции по сравнению с исходным уровнем указывает на присутствие амилоидов в надосадочной жидкости культуры.

Протокол

1. Анализ цитотоксических надосадочных пластов

1. Чтобы провести анализ на тиофлавин T (ThT), используйте флуоресценцию ThT для количественного определения амилоидов в надосадочной жидкости. Для этих измерений используйте стерилизованные фильтром надосадочные потоки.
   1. Приготовьте стоковый раствор (50x) ThT, суспендировав 8 мг ThT в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). После смешивания отфильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм для удаления твердых частиц.
   2. Для измерений добавьте 20 мкл запаса ThT к 1 мл PBS в кювете спектрофотометра объемом 1 мл. Поместите разведенный образец в спектрофлуориметр.
   3. Измерьте базо....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Тиофлавин Т	Сигма Олдрич	Т3516
ПБС	Gibco	10010-023
Шприцевые фильтры 0,22 микрона	Многородность	SLGP033RS