Коинкубационный анализ для изучения конкурентных взаимодействий между штаммами бактерий

Аннотация

Источник: Speare, L., et al. Коинкубационный анализ для количественной оценки конкурентных взаимодействий между изолятами Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется анализ совместной инкубации, используемый для изучения того, как штаммы бактерий конкурируют в общей среде. Он широко применяется в микробиологии для выявления механизмов, таких как контактно-зависимое или контактно-независимое убийство, которые управляют этими взаимодействиями.

Протокол

1. Коинкубационные штаммы (рис. 1B, C)
   1. Смешайте эталонный штамм и конкурирующий штамм в соотношении 1:1 (v/v), добавив по 100 мкл каждого штамма (нормализовано до OD 1,0) в маркированную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. В качестве контроля смешайте референсный штамм с дифференциально помеченной версией самого себя (референсный штамм pVSV102 + референсный штамм pVSV208). Этот контроль необходим для последующего статистического анализа, чтобы определить, влияет ли присутствие конкурирующего штамма на рост эталонного штамма. Вихревой смеситель культуры в течение 1-2 с.
      ЗАМЕТКА: Этот шаг может потребовать оптимизации, так как начальное соотношение может значительно повлиять на результаты и, возможно, потребуется скорректировать.
   2. Повторите шаг 1 для каждой биологической репликации. После завершения этого этапа должно быть в общей сложности восемь пробирок со смешанными штаммами: четыре биологические репликации с дифференциально мечеными референсными штаммами (контроль) и четыре биологические репликации с дифференциально мечеными референсными штаммами и конкурирующими штаммами (экспериментальные).
   3. Нанесите по 10 мкл каждой контрольной и экспериментальной смеси на пластины Петри, содержащие агар LBS; Эти пятна культуры будут использоваться для флуоресцентной микроскопии после инкубации.
   4. Дайте пятнам полностью высохнуть на скамейке, пока вся жидкость не впитается в агар, и инкубируйте пластины Петри при температуре 24 °C в течение 24 часов. Для того, чтобы штаммы V. fischeri , помеченные pVSV102 и pVSV208, выросли до достаточно высокой плотности клеток, чтобы визуализировать зеленый флуоресцентный белок (GFP) и красный флуоресцентный белок (RFP) соответственно на популяционном уровне с помощью флуоресцентного препарирующего микроскопа. Здесь мы используем 24-часовую инкубацию для визуализации смешанных пятен.
      ЗАМЕТКА: Важно использовать тарелки, которые не являются слишком влажными или слишком сухими. Если пластины будут слишком влажными, пятна коинкубации не впитаются в агаровую пластину; Избегайте использования тарелок, налитых в тот же день. Если пластины слишком сухие, на поверхности агара могут образоваться небольшие волны или трещины, что сделает пятна коинкубации неправильной формы.

Результаты

Рисунок 1: Блок-схема, иллюстрирующая анализ коинкубации. (A) Штаммы бактерий, содержащие либо pVSV102 (референсный штамм обозначен как Ref. Strain или R.S.), либо pVSV208 (конкурирующий штамм обозначен как Comp. Strain или C.S.), в...

Материалы