$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Пробирный анализ гальванического покрытия
ЗАМЕТКА: Анализ гальванического покрытия измеряет концентрацию клеток, способных генерировать колониеобразующую единицу (КОЕ) в образцах культур. Эта процедура позволяет выявить скорость, с которой одна клетка делится на две жизнеспособные клетки, и позволяет обнаружить остановки деления клеток (например, увеличение времени генерации бактерий при лизисе клеток).
- Готовят 10-кратные серийные разведения до 10-7 из 200 мкл образца культуры в свежей среде. Планшет 100 мкл соответствующего разведения на неселективных агарозных планшетах Лурия-Бертани (LB) для получения от 3 до 300 колоний после ночной инкубации при 37 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: Серийное разведение в свежей среде должно быть выполнено быстро, чтобы ограничить деление бактерий. В качестве альтернативы исследователи могут рассмотреть возможность использования солевого раствора без источника углерода для предотвращения деления клеток в процессе разбавления.
- На следующий день подсчитайте количество колоний, чтобы определить концентрацию жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) в каждом образце культуры. Построение графика коэффициента КОЕ/мл в зависимости от времени для необработанных и обработанных клеточных культур.
2. Проточная цитометрия
ЗАМЕТКА: В следующем разделе описывается подготовка образцов клеток к анализу проточной цитометрии. Этот метод анализа позволяет выявить распределение размеров клеток и содержания ДНК для большого количества клеток. По возможности рекомендуется немедленно обработать образцы проточной цитометрии. В качестве альтернативы образцы можно держать на льду (до 6 часов) и анализировать одновременно в конце дня после проведения гальванического покрытия и микроскопии.
- Разведите 250 мкл образца культуры с получением 250 мкл при концентрации ~15 000 клеток/мкл (что соответствует наружному диаметру600 нм ~0,06) в свежей среде при 4 °C.
ЗАМЕТКА: Инкубация на льду ограничит рост и морфологическую модификацию клеток. В качестве альтернативы пользователь может рассмотреть возможность проведения фиксации клеток в 75% этаноле, как обычно рекомендуется при проточной цитометрии. - Для окрашивания ДНК смешайте бактериальный образец с раствором флуоресцентного красителя ДНК с концентрацией 10 мкг/мл (соотношение 1:1) и инкубируйте в темноте в течение 15 минут перед анализом образца.
- Пропустите образец в проточный цитометр со скоростью потока ~120 000 клеток/мин. Регистрируйте пряморассеянный (FSC) и боковой рассеянный (SSC) свет, а также флуоресцентный сигнал флуоресценции ДНК на красителях (FL-1) с соответствующими настройками.
- Постройте гистограммы плотности клеток FSC и FL-1, чтобы представить распределение размера клеток и содержания ДНК в клеточной популяции.