Электрофизиологические Записи из гигантских Путь волокна D. MELANOGASTER</em

Hrvoje Augustin; Marcus J. Allen; Linda Partridge

doi:10.3791/2412

Методическая статья

Электрофизиологические Записи из гигантских Путь волокна D. MELANOGASTER

15.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2412

⸱

14 января 2011 г.

Hrvoje Augustin¹ , Marcus J. Allen² , Linda Partridge¹

¹Institute of Healthy Ageing, and GEE, University College London - UCL, ²School of Biosciences, University of Kent

В этой статье

Краткое содержание

Гигантская система Волокно простой нейронной схемы взрослых Дрозофилы Содержащий самую большую нейронов в лету. Мы опишем протокол для мониторинга синаптической передачи через этот путь, записав сообщение синаптические потенциалы в спинном продольной (DLM) и tergotrochanteral (TTM) следующие мышцы прямой стимуляции Гигантские интернейронов Fiber.

Аннотация

Когда испуганный взрослых D. MELANOGASTER реагировать, прыгнув в воздух и улетает. Во многих видов беспозвоночных, в том числе Д. MELANOGASTER, "побег" (или "испуга") ответ во взрослой стадии опосредовано многокомпонентных нейронную схему называют гигантские системы волокон (GFS). Сравнительный больших размеров нейронов, их отличительные морфологии и простое подключение делают GFS привлекательную систему моделью для изучения нейронных цепей. Путь GFS состоит из двух двусторонней симметричной Гигантские волокна (GF) интернейронов аксоны которых происходят от мозга по средней линии в грудной ганглий через шейки соединительной. В mesothoracic neuromere (T2) брюшной ганглиях форме GFs электро-химических синапсов с: 1) большой медиальной дендритов ипсилатерального motorneuron (TTMn), который дисков tergotrochanteral мышцы (ТТМ), основной экстензором для mesothoracic бедра / ноги , и 2) контралатеральной периферического synapsing интернейронов (PSI), который, в свою очередь образует химические (холинергических) синапсы с motorneurons (DLMns) спинного продольные мышцы (DLMS), крыло депрессоров. Нейронные пути (ей) dorsovental мышц (DVMS), крыло лифтов, до сих пор не разработаны (DLMS и DVMS известны совместно как косвенные летательные мышцы - они не прикреплены непосредственно к крыльям, а двигаться Крылья косвенным путем искажения неподалеку грудной кутикулы) (Король и Вайман, 1980;. Аллен и др., 2006). Ди-синаптической активации DLMS (через PSI) вызывает небольшой, но важный задержка в сроках сокращения этих мышц по отношению к моносинаптических активации ТТМ (~ 0,5 мс), что позволяет TTMs сначала расширить бедра и продвинуть летать над землей. TTMs одновременно растянуть активировать DLMS который в свою очередь взаимно стретч-активировать DVMS на время полета. Путь GF может быть активирована либо косвенным путем применения сенсорных (например, "воздух-пуф" или "огни-офф") стимул, или непосредственно выше порога электрической стимуляции головного мозга (описано здесь). В обоих случаях, потенциал действия достигает TTMs и DLMS исключительно через GFs, ПСИ, а TTM / DLM мотонейронов, хотя TTMns и DLMns есть другие, еще неизвестные, сенсорные входы. Измерение "задержки ответа" (время между стимуляцией и мышечной деполяризации) и "после высокой частоты стимуляции" (количество успешных ответов на определенное количество стимулов высокой частоты) предоставляет возможность воспроизводимо и количественно оценивать функциональное состояние из GFS компонентов, в том числе и центральных синапсов (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) и химического (глутаматергической) нервно-мышечного соединения (TTMn-ТТМ и DLMn-DLM). Он был использован для идентификации генов, вовлеченных в формирование синапсов центральной и оценить ЦНС функции.

Протокол

1. Оборудование и материалы

Эти эксперименты использовании стандартной установки электрофизиологии состоит из стимулятор, единица стимулом изоляции, два усилителя микроэлектрода, системы сбора данных и компьютер с коллекцией программного обеспечения. Дополнительное оборудование включает в клетку Фарадея, стереомикроскопа на бум стенд, стол виброизоляции, источник света, а также записи платформы.
Пять микроманипуляторами используются. Два микроманипуляторами требует тонкой управления для позиционирования записи электродов, в то время как остальные три микроманипуляторами требуют только валовой управления в положение два стимуляции электродов и боковой электрод. Микроманипулятора для электродов записи DLM помещается в самом конце приготовления (слева от экспериментатора) и микроманипулятора для записи ТТМ электрод помещается между экспериментатором и сторона подготовки (немного слева от экспериментатора). Два микроманипуляторами, который будет содержать моделирования электроды помещаются во главе подготовки (право экспериментатора). Микроманипулятора для боковой электрод размещается на обратной стороне подготовки
Вытяните микроэлектродов стекла записи с сопротивлением 40-60 МОм и хранить в горизонтальном положении в блюдо поддерживается воском. Для стимуляции, две электролитически (NaOH) заостренными электродами вольфрама используются. Вольфрамовой проволоки, или третье электролитически сфабрикованы электрода используется в качестве земли. Стимулирования и землю электроды готовы и прикреплен к микроманипуляторами до начала экспериментальной сессии, и не обязательно должны быть заменены на время сессии.

2. Подготовка D. MELANOGASTER

После того как оборудование настроено, настало время подготовить мух. Обезболить пролетает охлаждения на них льда или с помощью CO _2. Если CO ₂ используется, то достаточно времени (около 20 минут) для воздействия газа стираться до начала эксперимента.
Используйте пинцет для передачи мухами осторожно ноги, чтобы блюдо с платформой мягкий воск наклонной под углом примерно 45 °. Следующие четыре шага делается под микроскопом рассекает от (но близко к нему) записывающего оборудования.
Следующим шагом является обеспечение летать в воск. Восток летать вентральной стороной вниз, с его передней вверх по склону. Используя пару тонких щипцов, расширить ноги наружу, в парах, и помещаем их в воск.
Ознакомьтесь с расположением мышц для записи от: спинные продольные мышцы, или DLM и tergotrochanteral мышц или TTM. Подкожный сайтов прикрепления DLMS соответствуют области между грудной и средней линии передней спинной щетины (или щетинки). Сайты ТТМ вложений расположены сверху на задней и передней сверх-крыльев щетиной. Убедившись, что крылья не будут препятствовать доступу к DLM или TTM волокна, удерживая крылья наружу и «клей» их воском.
Использование тонких пара щипцов, вытащить наружу хоботком осторожно, и закрепите его при погружении его в воск. Это очень важный шаг, который требует некоторой практики, поскольку хоботок мягкой и легко отделяется от остальной части головы. Если это произойдет, выбросьте летать и начать все сначала. Неспособность обеспечить голове, таким образом, приводит к проблемам при вставке стимулирующих электродов через глаза.

3. Размещение электродов

Как только летать крепится к воска, передача блюдо с прилагаемой летать под стереомикроскопа, что находится внутри клетки Фарадея. Восток летать боком с головой летают справа от экспериментатора.
Следующим шагом является установка электродов. Наземные и стимулирующих электродов может быть вставлен, не глядя в микроскоп. Хорошие записи полагаются на точные сажание на кол, так что это хорошая идея на практике обработки микроманипуляторами. Принесите электродов близка к сайтам вставки с помощью микроманипуляторами чтобы облегчить их надлежащего размещения и последующей записи.
Нижний боковой электрод в заднем конце брюшка использованием регулировки колес на микроманипулятора. Чтобы разместить заостренными вольфрама стимулирующих электродов в мозг, используйте микроманипулятора в положение кончика одного из электродов поэтому она не коснется одного из глаз мухи. Сделайте то же самое с другом так, как электроды просто прикоснувшись вне каждого глаза. Затем нажмите электродов, в свою очередь, через каждый глаз так, кончики электродов достигает мозга расположен в задней части головной капсулы (около 2-3мм).
Правильно размещены электроды активируют Гигантская система Fiber. Чтобы проверить, что стимулирующие электроды расположены правильно, применяют короткие (0,03 мс) стимулом 30-60V через стимулирующих электродов, а также искать движением крыльев и дергается полета / ноги мускул "
Следующий шаг заключается в спине заполнения стекла микроэлектродов с 3M KCl использованием Гамильтон или тепловой вытащил пластиковый шприц, и поместить их в тонкую контроль микроманипуляторами. Правильно установлена микроэлектродов может быть использован для нескольких раундов экспериментов.
Первый электрод запись будет вставлена в волокна DLM. Есть два двусторонней симметричной DLMS, каждый из которых состоит из шести отдельных мышечных волокон. Запись может быть выполнена с любого из шести волокна, однако наиболее часто используемые DLM волокна 45а и 45б из-за их хорошую доступность через спинной стороне грудной кутикулы, а также тот факт, что оба волокна иннервируются же motorneuron .
Использование микроманипулятора на стороне дальней от вас, вставить электрод в записи DLM волокна 45а или b. Наклон платформы позволяет DLM электрода, чтобы войти в спинной кутикулы на ~ 60-90 градусов, что способствует проникновению. Использование программного обеспечения в режиме осциллографа и посмотреть на мониторе компьютера при вставке записи электродов в грудную клетку. Когда электрод вошел мышц базовой упадет почти до нуля или отрицательного значения. Тест с одним стимулом, чтобы увидеть, если вы можете наблюдать мышц ответ.
Вставьте другой электрод запись в ТТМ ближайший к вам. Этот электрод вставляется сбоку, перед вами, из-за местоположения участка вложения мышцы. Снова наблюдаем монитора, делая это и тест с одним стимулом раз след указывает электрода в мышцу.

4. Стимулирование и Запись

Теперь вы готовы начать стимулирующий мозг и записи ответов от ног и летных мышц. Применяют короткие (0,03 мс) стимулов через стимулирующих электродов, начиная с 30 В и с увеличением до 60 В, пока вы наблюдаете ответа (то есть мышечных и деполяризации мышечных клеток, как наблюдать на мониторе компьютера). На оставшуюся часть эксперимента, установить напряжение 5-10 V выше порога срабатывания.
Для измерения задержки ответа, дать по крайней мере 5 одиночных раздражителей с 5-секундным периодом отдыха между каждым стимулом.
Определить "частота следования", предоставляя поездов стимулов с разной скоростью. Обычно 10 поездов из 10 стимулов приведены в 100 Гц (10 мс между каждым стимул), 200 Гц (5 мс между каждым раздражитель) и 300 Гц (3 мс между каждым стимула). Разрешить остальным течение 2 секунд между каждым поездом стимулов.

5. Результаты: Ответ задержек и частоты следования в гигантских Путь Волоконно

Ответ задержка времени между стимуляцией мозга и деполяризации мышц. Эта цифра сравнима ответ задержки для DLM и ТТМ на один стимул. Задержки между 0,7 и 1,2 мс для GF-ТТМ пути и от 1,3 до 1,7 мс для GF-DLM указывает путь здорового подготовки и правильной техники записи. Задержки может меняться в зависимости от генотипа, генетического фона, температуры и возраста.

Рисунок 1 (А и В). Представителю следы показывающие ответы записаны с TTMs и DLMS следующих один раздражитель для мозга.
Как показано здесь, записи с TTM показать больше изменчивость по амплитуде и форме постсинаптического потенциала (ПСП) по сравнению с теми из большого волокна DLM; это увеличение изменчивости происходит из-за небольшого размера ТТМ мышечных волокон. Эта изменчивость, однако, не влияет на задержку ответа значения для Гигантские оптоволокно до ТТМ пути.

Рисунок 1 (С и D). Далее "ответ задержки" следы от 4-х индивидуальных мух для ТТМ и DLM. Обратите внимание, TTM следы выставку изменчивость формы PSP, но ответа задержки не влияет. Для DLM там меньше изменчивость формы PSP.
Сравните "частота следования" на частоте 100 Гц, 200 Гц и 300 Гц путем расчета доли успешных ответов (из 10) как для DLM и ТТМ пути на каждой частоте стимуляции. При 100 Гц, как ТТМ и DLM следовать стимулы 1:1. При стимуляции частотах выше 100 Гц, DLM ответы начинают проявляться сбои, потому синапса посредника между двумя химическими интернейронов не имеет достаточно времени, чтобы восстановиться между стимулами. ТТМ ответов, однако, остаются 1:1 с стимулами даже за 300Гц.

Рисунок 2. Представителю следы показывающие "частота следования" записей. На 100 Гц, как TTMs и DLMS ответить на все 10 стимулов (слева). На 200 Гц, DLM ответы начинают работать неправильно (звездочка).

6. Представитель Результаты

Дикий тип коротколатентных ответов (стимулировали электроды помещаются в глаза, минуя сенсорные рецепторы и вызывая цепь непосредственно GF) зависят от генотипа, генетического фона, температуры и возраста, и диапазон от 0,7 до 1,2 мс для GF-ТТМ пути и 1,3 and1.7 мс для GF-DLM путь (Tanouye и Вайман, 1980, Фома и Вайман, 1984; Энгель и Wu, 1992; Аллен и Мерфи, 2007; Фелан и др., 2008;. Августин и др., неопубликованные). . Это очень короткий ТТМ задержка происходит из-за надежной GF-TTMn электрохимической синапс моносинаптических пути и больше DLM задержка происходит из-за disynaptic характер пути, а также наличие химического синапса (PSI-DLMn). Средней и долгосрочной задержки ответов (> 3 мс) в результате активации афферентов GF и достигается либо за счет использования более низкой интенсивности стимуляции или предоставления визуальной («свет-офф") сигнала. На 100 Гц и ТТМ и DLM должны следовать стимулы 1:1. Выше 100 Гц DLM ответы начнет проявляться сбои, как химический синапс между ИОО и DLMns не имеет достаточно времени, чтобы восстановиться между стимулами менее 10 мс друг от друга. ТТМ ответов, однако, останется 1:1 с стимулами даже за 300 Гц (Tanouye и Вайман, 1980; Энгель и Wu, 1992;. Аллен и др., 2007;. Мартинес и др., 2007). Мутации в гене shakB, кодирование дрозофилы щелевых контактов канала ("innexin"), значительно увеличит задержку ответа GF-ТТМ пути (~ 1,5 мс), в то время как GF-DLM филиал не отвечает на запросы (Аллен и Мерфи, 2007; Фелан и соавт., 2008). Мутант ответ может быть восстановлено путем стимуляции грудных ганглиев напрямую, демонстрируя, что отложенный эффект обусловлен не нарушается нервно-мышечной передачи. Способность следовать высоким стимуляции частоты также нарушения в этих мутантов по сравнению с мухами дикого типа, где GF-DLM и ГФ-ТТМ путей, как правило, в состоянии следовать 10 стимулов с пропорции 1:1 до 100 Гц и 300 Гц, соответственно. Важно отметить, что эти частоты значительно выше нормы частоты стимуляции полученных сокращающихся мышц во время устойчивого полета (3-10 Гц) (Hummon и Костелло, 1989).

Еще один параметр, используемый для описания стабильности выходы GFS является "рефрактерный период", или минимальное время между импульсами двойной стимул, который до сих пор производит два ответа от мышцы. Огнеупорных время колеблется в пределах 1-4 мс для TTMs и 7-15 мс для DLMS. Сравнительно долго рефрактерный период для DLMS происходит из-за сравнительно лабильные химические синапсы на PSI-DLMn перехода (Tanouye и Вайман, 1980; Gorczyca и Холл, 1984; Энгель и Wu, 1992; Банерджи и др., 2004;. Аллен и Godenschwege, 2010).

Обсуждение

Один из самых важных вещей, нужно обратить внимание при попытке получить высококачественную запись качество правильной ориентации и здоровья препарат. В идеале, лететь все равно должны быть живы в конце сессии записи и реагировать на электрические стимулы. Для записи электродов наиболее эффективно проникать грудной экзоскелет, муха должна быть приклеена к поверхности таким образом, чтобы образовать прямой угол с электродами, при необходимости вставки электродов может быть облегчен путем удаления части спинной грудной кутикулы с вольфрамовой скальпель тем самым подвергая DLM мышц полета (этот шаг предлагает дополнительное преимущество, делая это тяжелее для кончиков стеклянные электроды перерыва). Кроме того, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не подталкивать электродами через subcuticularly расположен DLMS и TTMs. Глава лету должны быть хорошо закреплены, чтобы обеспечить стимулирующие электроды должны быть правильно вставлена в мозг и, чтобы предотвратить их время вытащил во время записи сессии.

Благодаря своим размерам и хорошо описал морфологию, СГФ представляет собой один из наиболее доступных путей нейронов у дрозофилы. Проницаемость электрических синапсов малым молекулярным весом красителей трассирующими позволяет визуализировать электрически связанных нейронов, и несколько доступных GAL4 линии позволяют манипулировать уровнями экспрессии генов в подмножество клеток или групп клеток (Jacobs и др., 2000;. Аллен и соавт., 2006) В дополнение к выше преимуществ, как афферентные и грудного компонентов схемы отображения таких свойств, как привыкание, спонтанное восстановление и dishabituation, делая дрозофилы GFS удобной модельной системой для изучения нейронной пластичности (Энгель и Ву, 1996).

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана Wellcome Trust грант в LP

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
НАЗВАНИЕ	КОМПАНИИ	КПП. #	КОММЕНТАРИИ
S48 площади импульсный Стимулятор	Трава инструменты		http://www.grasstechnologies.com/
Стимуляция блок	Трава инструменты		http://www.grasstechnologies.com/
SIU5 РФ Трансформатор изоляторе	Трава инструменты		http://www.grasstechnologies.com/
5А двухканальный усилитель внутриклеточных Микроэлектродные	Получение инструменты		http://www.gettinginstruments.com/
DIGIDATA 1440A система сбора данных	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/
Аналого-цифрового DIGIDATA 1320 и Axoscope 9,0 программного обеспечения	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/
Запись платформы с ручным микроманипуляторами	Narishige, Саттер Ins., Всемирный Precision Ins.		http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/
Источник света	Fostec		http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm
Дикие M5 стереомикроскопа	Дикие Heerbrugg		http://www.wild-heerbrugg.com/
Таблица Виброизоляция	TMC		http://www.techmfg.com/
Боросиликатное труб для микроэлектродов	Саттер Инструмент		http://www.sutter.com/index.html
Р-95 микропипетки съемник	Саттер Инструмент		http://www.sutter.com/index.html
Microfil 34 калибр, 67 мм (электрод наполнитель)	Инструменты Всемирного Precision	MF34G-5	http://www.wpi-europe.com/en/
Микродиссекция инструменты (щипцы, ...)	Инструменты изобразительных наук		www.finescience.com
Пройдя (стерео) микроскоп	Leica		http://www.leica-microsystems.com/
Экранированная камера	Неизвестный производитель

Прочее: пластиковые шприцы, вольфрамовой проволоки земли и NaOH-заостренные вольфрамовые электроды, KCl, воск платформы ПК с монитором ...

Ссылки

Allen, M. J., Godenschwege, T. Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System. Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual. Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. , 1st Lab ed, Cold Spring Harbor Press. (2010).
Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).
Allen, M. J., Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter. Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).
Banerjee, S., Lee, J. Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila. J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).
Engel, J. E., Wu, C. F. Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila. J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).
Gorczyca, M., Hall, J. C. Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis. J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).
Hummon, M. R., Costello, W. J. Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers. J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).
Jacobs, K., Todman, M. G. Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target. Development. 127, 5203-5212 (2000).
King, D. G., Wyman, R. J. Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway. J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).
Martinez, V. G., Javadi, C. S. Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila. Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).
Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. Demerec, M. , 2nd, Hafner. New York. 502-503 (1965).
Phelan, P., Goulding, L. A. Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system. Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).
Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).
Tanouye, M. A., Wyman, R. J. Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila. J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).
Thomas, J. B., Wyman, R. J. Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila. J Neurosci. 4, 530-538 (1984).