Адаптивная эволюция бактерий с использованием системы микрокапельного культивирования

Аннотация

Источник: Jian, X., et al., Автоматизированное микробное культивирование и адаптивная эволюция с использованием микробной системы культивирования микрокапель (MMC). J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео демонстрируется использование микробной системы культивирования микрокапель для стимулирования адаптивной эволюции бактерий в направлении толерантности к метанолу. Смешивая модифицированные бактериальные культуры со средой с высоким содержанием метанола и разделяя их на микрокапли, система отбирает мутантов, которые демонстрируют улучшенный рост под воздействием метанола. С помощью итерационных циклов обогащения и выделения колоний адаптированные к метанолу штаммы бактерий культивируются для дальнейшего анализа или применения.

Протокол

Адаптивная эволюция в MMC

1. Приготовление исходного бактериального раствора
   1. В соответствии с соответствующими стандартными нормами подготовьте специальные жидкие средние и твердые пластины для MeSV2.2 и автоклавы при температуре 121 °C в течение 15 минут.
   2. Культивируйте MeSV2.2 с помощью твердой пластины (диаметр = 90 мм) в инкубаторе с постоянной температурой 37 °C в течение 72 часов. Затем выберите самостоятельную колонию и выращивайте ее в колбе объемом 50 мл с 10 мл специальной жидкой среды в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при температуре 37 °C в течение 72 ч.
   3. Разбавьте культивированный раствор MeSV2.2 средой до наружного диаметра₆₀₀ 0,1-0,2 (убедитесь, что общий объем должен быть не менее 10 мл) и продолжайте культивирование его в колбе для встряхивания в течение 5 ч до получения исходного раствора бактерий.
      ЗАМЕТКА: MeSV2.2 — это незаменимый для метанола штамм кишечной палочки . Специальная жидкая среда содержит 500 ммоль/л метанола, который является сильным стрессом для MeSV2.2, что приводит к очень медленному росту.
2. Инициализируйте MMC.
3. Достаньте два стерилизованных флакона с реагентом, один из которых предназначен для исходного раствора бактерий, а другой – для свежей среды. Введите исходный раствор бактерий (5 мл), свежую среду (12-15 мл) и масло MMC в флаконы с реагентами.
   ЗАМЕТКА: Поскольку адаптивная эволюция является долгосрочным процессом, включающим в себя несколько субкультур, храните как можно больше свежей среды в MMC. Среда не может быть восполнена во время эксперимента.
4. Установите два флакона с реагентами в MMC. Установите один для исходного бактериального раствора между разъемом C2 и O2, а другой для свежей среды между разъемом C4 и O4.
5. Нажмите на ALE, чтобы выбрать функцию адаптивной эволюции (рис. 1B). В интерфейсе настройки параметров включите переключатель Обнаружение наружного диаметра.

6. Установите число 50, длину волны 600 нм, концентрацию 0%, тип времени, параметр 30 ч и количество повторений 99. Нажмите «Старт», чтобы начать генерацию капель. Это займет около 25 минут.
   ЗАМЕТКА: Здесь «концентрация» относится к максимальной концентрации химических факторов для адаптивной эволюции. Для разных капель в ГМК можно вводить различные концентрации химических факторов для обеспечения различных условий роста. Рассчитаем введенные концентрации с помощью следующей формулы:

   

   Здесь «С» относится к концентрации химических факторов, вводимых в капли; «а» относится к концентрации химических факторов в флаконах с реагентами между разъемом С4 и О4; «b» относится к концентрации химических факторов в флаконах с реагентами между разъемом C6 и O6; А «i» относится к доступной концентрации. В MMC доступно восемь концентраций. Поскольку химический фактор здесь имеет единственную концентрацию (500 ммоль/л метанола) и является одним из ингредиентов среды, здесь установлен только один флакон с реагентом, содержащий химический фактор, а концентрация установлена равной 0%. Тип относится к режиму субкультивации, который делится на три типа: режим времени, режим значения OD и режим флуоресценции. Первый означает культивирование капель в течение фиксированного времени, а затем субкультивирование, в то время как последние два означают культивирование капель до заданного значения OD/интенсивности флуоресценции, а затем субкультивирование. Параметр относится к соответствующему параметру, необходимому при выборе режима субкультивации. Повторения относятся к количеству подкультиваций.

7. Снимите флакон с реагентом, помещенный между разъемами C2 и O2.
8. Посмотрите, значительно ли увеличились максимальные значения OD капель в течение каждого периода субкультивации. Если увеличение происходит и соответствует требованиям эксперимента, нажмите кнопку «Экспорт данных», чтобы экспортировать данные OD.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь период подкультивации зависит от параметра. Например, если для параметра Тип задано значение Время, а для параметра установлено значение 30 ч, период всобработки составляет 30 ч. В течение каждого периода субкультивирования существуют максимальные значения OD капель. Оцените, удовлетворяет ли адаптивная эволюция требованиям эксперимента по увеличению максимальных значений OD (увеличение зависит от фактического процесса культивирования штамма, например, увеличенного более чем на 20%). ВНИМАНИЕ: Обратите внимание на то, не исчерпана ли хранящаяся свежая среда. Если значительного увеличения не произошло даже после того, как среда исчерпана, извлеките лучше растущие капли и проведите новый раунд адаптивной эволюции.
9. Извлеките целевые капли из MMC.
   1. Нажмите на кнопку Screening (Скрининг), чтобы выбрать функцию экстракции капель (Рисунок 1C). Выберите опцию «Собрать», нажмите на количество целевых капель, а затем нажмите «ОК».
      ЗАМЕТКА: Скрининг капель включает в себя команды «Собрать», «Выбросить» и «Извлечь раствор семян». «Экстракция семенного раствора» означает сбор оставшихся капель после операции субкультивации.
   2. Подождите, пока всплывающее окно не предложит: «Пожалуйста, вытащите быстроразъемный разъем CF и вставьте его в трубку EP». Вставьте быстроразъемный соединитель CF в микроцентрифужную пробирку для сбора в соответствии с подсказкой программного обеспечения, а затем нажмите OK (Рисунок 2D).
   3. Через 1-2 минуты в интерфейсе программы появится новое окно с предложением: «Вставьте разъем обратно и нажмите «ОК», если все готово». Затем вставьте быстроразъемный разъем CF обратно и нажмите OK, чтобы MMC продолжил работу (Рисунок 2D).
      ЗАМЕТКА: После того как все целевые капли будут собраны, MMC продолжит культивирование оставшихся капель. Если обработка не требуется, нажмите «Стоп», чтобы немедленно завершить операцию.
   4. Извлеките каплю с помощью пипетки объемом 2,5 мкл, опустите ее на агарозную пластину диаметром 90 мм и равномерно распределите ее треугольным стеклянным стержнем со стороной 3 см. Затем выращивайте его в инкубаторе с постоянной температурой 37 °C в течение 72 часов.
   5. Выберите 3-5 самостоятельных колоний и отдельно культивируйте их в колбах объемом 50 мл с 10 мл свежей среды в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при температуре 37 °C в течение 48-72 ч. Следуйте соответствующим стандартным правилам хранения раствора культивируемых бактерий в глицериновой пробирке для последующих экспериментов.

Результаты

Рисунок 1: Интерфейс программного обеспечения MMC. (A) Основной интерфейс программного обеспечения. (1) Температура в рабочей камере. (2) Значение фотоэлектрического сигнала распознавания капель. Когда капля проходит, з...

Материалы