Подготовка микрофлюидной пластины с бактериальными клетками

Аннотация

Источник: Сатлиф, А. Л . и др. Анализ живых клеток сдвигового напряжения на Pseudomonas aeruginosa с использованием автоматизированной высокопроизводительной микрофлюидической системы. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется подготовка микрофлюидной пластины для исследований сдвигового напряжения в бактериальных культурах. После примывания каналов средой бактериальные клетки вводятся в экспериментальный канал и инкубируются для прикрепления. Остаточные среды и культура удаляются для подготовки системы к последующим экспериментам с сдвиговым напряжением.

Протокол

1. Подготовка медиа

1. Приготовьте минимальную среду (MM) с 0,25% глюкозы. Чтобы получить 1 л ММ с 0,25% глюкозы, добавьте 200 мл стерильного раствора соли M9, 2 мл стерильного 1 М сульфата магния (_{MgSO 4}), 100 мкл стерильного 1 М хлорида кальция (CaCl₂) и 12,5 мл стерильной 20% глюкозы (w/v) в воду (_{dH 2}O) при конечном объёме 1 л.
2. Перемещение необходимого материала в стерильную бутылку с помощью стерильных методов. Подготовьте нужное количество в зависимости от количества используемых каналов. Обычно для каждого канала требуется 200 мкл для запуска, 300 мкл для посева и 1300 мкл для 24-часового эксперимента.
3. Поставьте бутылку в инкубатор или водяную баню с экспериментальной температурой. Среда должна находиться в экспериментальной температуре перед использованием, чтобы избежать образования пузырьков в микроканалах.

2. Подготовка ночной и экспериментальной культуры штамма Pseudomonas aeruginosa PA01, экспрессирующего усиленный зелёный флуоресцентный белок (PA01-EGFP).

1. Поместите 15 мл экспериментальной среды в стерильную колбу и инокулятируйте одну-две колонии из агарной пластины, покрытой полосами PA01-EGFP. Размножайте культуру на 12-16 часов на инкубаторном столе/шейкере при 37 °C и 180-220 об/мин.
2. Измерьте_{OD 600} в ночных культурах. Когда_{OD 600} превышает 0,80, ночную культуру разведите до окончательного OD 0,8 с помощью свежего MM. Поместите экспериментальную культуру в инкубатор или водяную баню при 37 °C до необходимости для посева микрофлюидных каналов. Проверьте_{OD 600} ещё раз перед посевом, чтобы убедиться, что он не изменился существенно по сравнению с целевым_{OD 600}, в данном случае 0,8.

3. Запуск оборудования

1. Настройте системную станцию согласно руководству пользователя, аналогично тому, как на рисунке 1. Чтобы избежать ошибки в соединении прибора с программным обеспечением, включите прибор в следующем порядке:
   Рабочая станция для ПК
   Модуль флуоресценции. Убедитесь, что люминесцентный затвор ВКЛЮЧЕН (синий свет у кнопки затвора)
   Аппаратные контроллеры
   Контроллер системы визуализации (см. таблицу материалов)
   CCD-камера
   Станция визуализации (микроскоп)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температуру нагреваемой пластины следует отрегулировать до желаемой экспериментальной температуры.
2. Запустите приложение управления и введите номер номера, указанный на этикетке сбоку от знака.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После запуска управляющего приложения появятся два отдельных окна: одно для программного обеспечения, управляющего микроскопом/визуализационным ПО, и другое для управляющего модулем, управляющим насосом и интерфейсом скважины с пластиной.

4. Запуск и засев микрофлюидической пластины

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка, посев, прикрепление бактерий и рост показаны на рисунке 2.

1. Снимите микрофлюидную пластину на 48 ямок из упаковки, следя за тем, чтобы не касаться стеклянной поверхности внизу пластины. Очистите стеклянный стекло внизу пластины с помощью салфетки для линзы, тряпкой без ворса или салфеткой с низким количеством ворса.
2. Для подготовки микрофлюидных каналов в выходную яму, пипетка 200 мкл при температуре 37 °C MM в выходную яму, стараясь избежать пузырьков. Поместите пластину в пластинную стадию и протрите интерфейс этанолом, чтобы она высохла, а затем запечатайте на пластинной стадии.
3. В ручном режиме на модуле управления установите Fluid как
   Лурия-Бертани (LB) при 37 °C и Max Shear при 5,00 дайн/^{см 2}. Нажмите на выходные ямы, чтобы активировать поток от выхода к входной яме, запуская каналы. После 5-минутного грунтовки приостановите поток, чтобы подготовиться к посеву. Аккуратно уберите пластину со ступени и пипетки с выхода наносите остаточные носители, но не удаляйте материал из внутреннего круга, ведущего к микрофлюидным каналам.
4. Для засева экспериментальных каналов сначала вводят 300 мкл ММ в входную яму, затем пипетируют 300 мкл бактериальной культуры в выходную яму. Поставьте пластину обратно на стадию пластины, убедитесь, что вы протрёте интерфейс перед тем, как положить её на неё.
5. В модуле управления фокусируйтесь на одном канале с помощью прямой камеры после установки пластины на стадии микроскопа. Во время визуального мониторинга с помощью живого потока возобновите поток при 1,00-2,00 дайн/^см² примерно в течение 2-4 секунд, чтобы клетки могли войти в экспериментальный канал, но не в серпантинные каналы. Оставьте пластину на температурно-контролируемом ступени на 1 час, чтобы обеспечить её прикрепление. Во время 1 часа инкубации можно настроить управляющий модуль и программное обеспечение монтажа для автозапуска.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для посева, зависит от среды и организма, поэтому его следует внимательно контролировать живой подачей до оптимизации и использования в качестве общего временного интервала. Посев по всей плите может варьироваться, что потребует больше времени для подачи в определённые колонны каналов для полного посева.
6. После периода крепления аккуратно снимите пластину со ступени и сначала пипеттуйте бактерии с выхода, чтобы не нарушать канал. С новым наконечником пипетки удалите среду из входных колодц.

Результаты

Рисунок 1: Отдельные компоненты микрофлюидической системы. Отдельные компоненты перечислены слева направо: 1. CCD-камера, 2. Высокоразрешающий инвертированный микроскоп с автоматизированным ступенем, автоматизированным модулем флуоресценции...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хлорид аммония, ACS	VWR	BDH9208-500G	Часть минимальной медиа-композиции
BioFlux 1000 с 48 лунками с низким сдвигом	Fluxion Biosciences	910-0047
Микрофлюидическая система визуализации BioFlux 1000Z	Fluxion Biosciences	BF 1000Z
Дигидрид хлорида кальция, класс ACD	VWR	97061-904	Часть минимальной медиа-композиции
Декстроза, Безводная, ACS	VWR	BDH9230-500G	Часть минимальной медиа-композиции
Сульфат магния ACS класса	VWR	EM-MX0070-1	Часть минимальной медиа-композиции
Калийфосфат монобазовый, класс ACS	VWR	BDH9268-500G	Часть минимальной медиа-композиции
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	Бактериальный штамм Pseudomonas aurinosa PA01 с модификацией GFP используется для этого исследования.
Хлорид натрия, ACS	VWR	BDH9286-500G	Часть минимальной медиа-композиции
Фосфат натрия, монобазовый, безводный, реагентный сорт	VWR	97061-942	Часть минимальной медиа-композиции