Количественное измерение GLUT4 транслокации к плазматической мембраны с помощью проточной цитометрии

Краткое содержание

Этот протокол описывает быстрый метод количественного транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану клеток методом проточной цитометрии.

Аннотация

Глюкоза является основным источником энергии для организма, требующий постоянного регулирования его концентрацию в крови. Высвобождение инсулина в поджелудочной железе вызывает потребление глюкозы по инсулин-чувствительных тканей, в первую очередь мозг, скелетные мышцы и адипоциты. Пациенты, страдающие от 2-го типа диабета и / или ожирение часто развивается резистентность к инсулину и не в состоянии контролировать свои гомеостаз глюкозы. Новое понимание механизмов резистентности к инсулину может предоставить новые стратегии лечения для 2-го типа сахарного диабета.

GLUT семейства глюкозы перевозчиков состоит из тринадцати членов, распределенных на разных тканях по всему телу ^1. Глюкоза транспортер типа 4 (GLUT4) является основным транспортером, который служит посредником глюкозы к инсулину чувствительные ткани, например, скелетных мышцах. После связывания инсулина со своим рецептором, пузырьки, содержащие GLUT4 перемещать из цитоплазмы в плазматическую мембрану, вызывая глюкозы. Уменьшение GLUT4 транслокации является одной из причин инсулинорезистентности у 2-го типа диабета ^2,3.

Транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану могут быть визуализированы на иммуноцитохимии, используя флуорофора-сопряженных GLUT4-специфических антител.

Здесь мы опишем метод количественного общей суммы GLUT4 транслокации к плазматической мембраны клеток при выбранной длительности, с помощью проточной цитометрии. Этот протокол является быстрое (менее 4 часов, в том числе инкубации с инсулином) и позволяет проводить анализ всего лишь 3000 клеток или почти 1 млн. клеток на состояние в одном эксперименте. Он опирается на анти-GLUT4 антитела, направленные на внешний эпитопу транспортер, которые связывают с его, как только он был открыт для внеклеточной среде после транслокации в плазматическую мембрану.

Протокол

1. Сотовые Окрашивание

1. Подготовка клетки. Клетки должны быть использованы в то же время активно развивается (60 - 80% слияния). Сыворотка голодать клетки на ночь, пластинка их клетки на уровне 0,1 млн. долл. и в 0,5 мл бессывороточной среде в 24-луночного планшета и поместите в инкубатор (37 ° C, 5% СО ₂₎ в течение 30 минут - 2 часа, чтобы восстановить от трипсинизации.
2. Смешайте первичного и вторичного антитела. Mix (5 мкл первичных анти-GLUT4 антитела с 1 мкл вторичных куриные анти-IgG антител козы конъюгированных с AlexaFluor 488) х количество скважин. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре, в темноте.
3. Подготовка 2X рабочий запас инсулина путем разбавления ее в среду.
4. Убедитесь, что клетки присоединились или нет.
5. Аккуратно добавить 6 мкл смеси антител и 0,5 мл 2 раза ваш рабочий запас инсулина для скважин содержащих клеток. Избегайте любой турбулентности среды. Инкубируйте (37 ° C, 5% СО ₂₎ в течение 30 минут, в темноте.
6. Fix клетки, добавляя 0,5 мл ФСБ + 1% PFA в каждую лунку, без встряхивания клеток. Инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре, в темноте.
7. Если ваши клетки придерживаются скважин, слегка приподнимите их ячейки Колмар. Передача клетки (1 мл общего числа) в пробирки, которые вписываются в ваш проточный цитометр и центрифуга для осаждения клеток.
8. Вымойте гранул в два раза с 1 мл PBS и ресуспендируют в 0,4 мл PBS + 1% PFA. В этот момент клетки могут быть завернуты в фольгу и хранить в холодильнике (4-8 ° С) или приняты для потока цитометр для немедленного сбора данных.

2. Сбор данных

1. Установить широкие ворота вокруг живых клеток в сторону рассеяния (SSC) по сравнению с разбросом вперед (ФТС) панели. Используйте отрицательные трубки (клетки не получавших инсулин или ячейки "окрашенные" с изотипа управления), чтобы установить параметр FL1. Убедитесь, что пик полностью на панели, а не заключать на нижней стороне.
2. Получения данных, по крайней мере 10 000 клеток на трубе.

3. Анализ данных

1. Нарисуйте ворот вокруг живых клеток в SSC против ФСБ панели (рис. 1А). Участок гистограммы AlexaFluor 488 интенсивности флуоресценции от числа клеток в живых-клеток ворот (рис. 1В). Можно наложить различные гистограммы для визуализации различий, но для количественного, определить среднее и медиана интенсивности флуоресценции для каждой ячейки населения и использовать эти номера для Вашего сравнения (рис. 1в).
2. Нормализация данных значения, полученные в отсутствие инсулина, как показано на рисунках 1C и 1D.

4. Представитель Результаты

В миобластов изолированы от здорового человека (без резистентности к инсулину), инсулин вызывает дозозависимое транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану (рис. 1, слева). В отличие от этого, инсулин не вызывает GLUT4 транслокации к плазматической мембране миобластов изолированы от больных с резистентностью к инсулину (рис. 1, справа).

Рисунок 1. Пример окрашивания эксперимента. Миобластов были изолированы от донора без резистентности к инсулину (слева) и от пациентов с резистентностью к инсулину (справа)., SSC (боковой разброс) по сравнению с FCS (вперед разброс) сюжет с воротами вокруг живых клеток. B, клетки в закрытом , окрашивали антителами против внешних эпитопу GLUT4, и оставил нестимулированных (красный) или стимулированный инсулином 1 нм (синий), 10 нм (оранжевый), или 100 нм (зеленый). Для фигуры ясности, мы показываем только данных без и с 100 нМ инсулина для клеток с резистентностью к инсулину. C, средняя интенсивность флуоресценции (МФО) из гистограммы показаны на В были нормированы на МФО клеток левой нестимулированных (без инсулина). D, Земельные нормализованные данные МФО из гистограммы показан на B.

Обсуждение

Мы продемонстрировали быстрый метод для количественного транслокации GLUT4 из цитоплазмы в плазматическую мембрану клеток методом проточной цитометрии.

GLUT4 только временно, высказанные на плазматической мембране клеток и эндоцитарных. Так связанных антител остаются прикрепленными к GLUT4, даже во время эндоцитоза, сигнал флуоресценции дает общую сумму GLUT4, что подвергался в плазматической мембране при выбранной длительности инкубации в присутствии инсулина.

Этот метод может быть применен и к изучению перемещения других белков из внутриклеточных отсека мембране, при условии хорошей антитела, направленные на внешний эпитопу белка интерес имеется. Например, подобный анализ в настоящее время широко используется для оценки скорости дегрануляции цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных лимфоцитов убийца, измеряя перемещение CD107a их плазматической мембраны ^4,5. Транслокации фосфатидилсерина с внутренней стороны плазматической мембраны на внешней стороне во время апоптоз или некроз также могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии, используя флуорофора меченных Аннексин V ^6.

Кроме быстроты анализа, проточная цитометрия представляет преимущество, что позволяет изучение белков транслокации в плазматическую мембрану в смешанных популяциях клеток. В самом деле, можно объединить окрашивание на маркеры ячейки подмножество и для белок, а затем сбор данных на нескольких лазерных потока цитометр ^7.

Количество антител, указанные в пункте 1.2 протокола отправной точкой, мы рекомендуем вам титровать ваших антител с клетками, представляющие интерес для определения минимальной концентрации антител, который дает вам максимальный сигнал. Хорошая отправная диапазон для первичного анти-человеческий GLUT4 антител мы использовали здесь будет 1-10 мкл на трубке (т.е. 0,2-2 мкг антител на трубке), каждый из трубки, содержащей не более чем на 1 млн. клеток. Для других первичных антител, обратитесь к инструкциям поставщика.

Нормализация данных необходима как флуоресценции клеток будет варьироваться от донора к донора и от эксперимента к эксперименту.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитела к GLUT4 человека	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1606	Против внешнего эпитопа GLUT4
Куриные антитела к IgG козы, конъюгированные с AlexaFluor 488	Invitrogen	A-21467
Рекомбинантный инсулин человека	Sigma-Aldrich	I2643
Скреперы для клеток	VWR international	29942-118	Обрезаны по размеру лунок
Пробирки объемом 5 ml для FACS	VWR international	60819-138	Подходят для всех приборов BD