Оценка роли иммунитета хозяина в инфекции микобактериями с помощью модели данио-рерио

Аннотация

Источник: Luukinen, H. и др. Моделирование туберкулёза у взрослых данио-реришей, инфицированных Mycobacterium marinum . J. Vis. Exp . (2018).

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Экспериментальная инфекция M. marinum при интрабрюшинеальной инъекции

1. Пипетить каплю разбавленного бактериального раствора объёмом 5 мкл на кусок парапленки и втянуть каплю в иглу инсулина на 30 G.
2. Для эксперимента используйте диких рыб возрастом 5–8 месяцев и мутантную рыбу rag1−/−hu1999. Обезболить взрослую данио-рерио в воде в аквариуме этилэфиром 0,02% 3-аминобензойной кислоты (pH 7,0). Расположите рыбу вентральной стороной вверх в щель на влажном пенистом пластике.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мутантные рыбы Rag-/ - не способны пройти соматическую рекомбинацию и производить функциональные T и B-клетки.
3. Вводите иглу между тазовыми плавниками под углом примерно 45°. Держите иглу открытой вверх, чтобы убедиться, что всё отверстие находится внутри брюшной полости. Медленно вводите бактериальную суспензию и аккуратно убирайте иглу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если красный трассер протекает из рыбы при инъекции, исключите рыбу из эксперимента.
4. Сразу после инъекции переместите рыбу в резервуар с пресной водой.
5. Берите образцы бактериальной суспензии на пластинах 7H10 каждые 15 минут из используемого бактериального аликвота и инкубируйте бактерии при 29 °C в течение 5 дней, после чего проверяйте дозу инфекции, считая колонии на пластинах.
6. Регулярно проверяйте состояние рыб и усыпляйте всех рыб с симптомами инфекции концентрацией этилового эфира более 0,02% 3-аминобензойной кислоты (pH 7,0).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно 7% взрослых данио-рерио, инфицированных 34 ± 15 CFU, и 30% данио-рерио, инфицированных 2029 ± 709 CFU, будут иметь симптомы к 8 недеям 19. Симптомы могут включать аномальное плавание, отсутствие реакции на прикосновения, задыхание, отёки или заметное истощение.
7. Поддерживайте данио-рерио в соответствии с общими стандартами

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Mycobacterium marinum	Коллекция американской типографической культуры	ATCC 927
Middlebrock 7H10 агар	BD, Thermo Fisher Scientific	11799042
Обогащение Middlebrock OADC	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Middlebrock 7H9 medium	BD, Thermo Fisher Scientific	11753473
Обогащение Middlebrock ADC	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Фосфатно-буферные физиологические таблетки (PBS)	Сигма-Олдрич	P4417-50TAB
Фенол красный	Сигма-Олдрич	P3532
Игла 27 G	Хенке Сасс Вольф	4710004020
Шприц объёмом 1 мл	Хенке Сасс Вольф	4010.200V0
Инсулиновая игла Omnican 100 30 G	Браун	9151133
3-аминобензойная кислота этилового эфира (pH 7,0)	Сигма-Олдрич	A5040