Методическая статья

Протокол Рекомбинантный РосБР основе вакцины атипичной пневмонии: белковый препарат, вакцинация животных и нейтрализации Обнаружение

DOI:

10.3791/2444

⸱

2 мая 2011 г.

 ,  ,  , 
1Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает общий порядок для изучения рекомбинантный рецептор-связывающий домен (РосБР)-вакцины на основе субъединиц против атипичной пневмонии. Она включает в себя методы для трансфекции и экспрессии белка в РосБР 293T клеток, иммунизация мышей с РосБР и обнаружения нейтрализации активности сыворотки мыши использованием установленных pseudovirus ОРВИ нейтрализации анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основываясь на их профиль безопасности и способность вызывать мощный иммунный ответ против инфекций, субъединичные вакцины были использованы в качестве кандидатов на широкий спектр патогенных 1-3. Так как система млекопитающих клетка способна пост-трансляционной модификации, формируя таким образом правильно сложить и гликозилированного белков, рекомбинантных белков выражается в клетках млекопитающих, показали наибольший потенциал для поддержания высокой антигенность и иммуногенность 4-6.

Хотя никаких новых случаев заболевания атипичной пневмонией были зарегистрированы с 2004 года, будущие вспышки являются постоянной угрозой, поэтому разработке вакцин против SARS-коронавирус является разумным шагом превентивных и должны быть выполнены. РосБР белка SARS-коронавирус S играет важную роль в связывании рецептора и индукцию специфичных нейтрализующих антител против вирусных инфекций 7-9. Таким образом, в этом протоколе описываются новые методы для развития РосБР основе субъединицы вакцины против атипичной пневмонии. Короче говоря, рекомбинантный белок RBD (rRBD) была выражена в супернатант культуры клеток млекопитающих 293T клетки для получения правильно сложенным белка с надлежащим конформации и высокой иммуногенностью 6. Трансфекции рекомбинантной плазмиды, кодирующей РосБР для клеток, то выполняется с помощью трансфекции фосфатом кальция методом 6,10 с некоторыми изменениями. По сравнению с методом трансфекции липидного 11,12, это изменение фосфата кальция трансфекции метод дешевле, проще в обращении, и имеет потенциал, чтобы достичь высокой эффективности раз трансфекции комплексе с подходящим размером и формой формируется 13,14. Наконец, нейтрализации ОРВИ pseudovirus анализа был введен в протокол и используется для обнаружения нейтрализующих активность сыворотки мышей, вакцинированных rRBD белка. Этот анализ является относительно безопасным, не связаны с инфекционными SARS-коронавирус, и может быть выполнена без требования биобезопасности-3 лаборатории 15.

Протокол, описанный здесь, может также быть использована для разработки и изучения рекомбинантных вакцин субъединицы против других вирусов с классом я слитые белки, например, ВИЧ-инфекции, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус Эбола, вирус гриппа, а также Нипах и Handra вирусов. Кроме того, методы генерации pseudovirus и впоследствии создание анализа pseudovirus нейтрализация может быть применен ко всем этим вирусам.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Рекомбинантный SARS-коронавирус РосБР белковый препарат

  1. Подготовка фосфата кальция трансфекции реагента
    1. 2X HBS буфера приготовления: Смешать 16 г хлористого натрия, 0,4 г Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, и 13,0 г HEPES. Отрегулируйте рН до 7,00 и воспитывать общий объем до 1000 мл в дистиллированной воде. После фильтрации раствор для стерилизации, аликвоты и хранить его при температуре -20 ° C.
      Подсказка: Любые изменения рН повлияет трансфекции результаты. Таким образом, желательно, чтобы проверить несколько значений рН около 7.00 (например, 6,99, 7,00 или 7,01) и найти лучший для трансфекции с использованием метода представлены ниже.
    2. 2,5 М CaCl 2 препарата: Добавить 73,5 г CaCl 2 * 2H 2 O в дистиллированной воде в конечном объеме 200 мл. Фильтры решение и хранить при температуре -20 ° C.
  2. Рекомбинантные плазмиды трансфекции и очистки белков
    1. Сплит 293T клеток на 50-70% слияния 24 часов до трансфекции. Рост клеток в Т-175 см 2 культуре ткани колбы в 40 мл DMEM, содержащей 10% тепла инактивированной (HI) FBS и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S) при 37 ° С в 5% СО 2.
    2. Все трансфекции реагенты должны быть доведены до комнатной температуры перед трансфекции. Эти реагенты включают 2X HBS, 2,5 CaCl 2, DIH 2 O, и rRBD плазмиды 6.
      Подсказка: окончательное рекомбинантной плазмиды построить для экспрессии белка должно содержать сигнальный пептид для обеспечения секреции выразил рекомбинантных белков в культуру супернатанта. 6x теги Его могут быть добавлены в C-терминал выразил белка для легкой очистки.
    3. Подготовьте 50 мл () и один 15 мл (B) BD Сокол трубки, а также добавлять реагенты для труб, как это указано в таблице 1. Добавить 2X HBS буфера в трубке А. В трубке В, добавить 2,5 М CaCl 2 и rRBD плазмиды, и довести объем потребности в DIH 2 O.
      А. Один Т-175 см 2 культуре ткани колбу (4000 мкл / флакон): подготовиться к rRBD выражение
      Труба Труба B
      2X HBS 2000 мкл 2,5 М CaCl 2 200 мкл
      rRBD ДНК плазмиды 40 мкг
      DIH 2 O в 2000 мкл
      B. Один 100-мм чашки Петри (1000 мкл / блюдо): подготовить для производства pseudovirus атипичной пневмонии
      Труба Труба B
      2X HBS 500 мкл 2,5 М CaCl 2 50 мкл
      Плазмиды SARS-коронавирус S ДНК 5 мкг
      ВИЧ-1-плазмиды (pNL4-3.luc.RE) 5 мкг
      DIH 2 O в 500 мкл
      Таблица 1. Трансфекция подготовки смеси и объемы
      Объемы перечисленных в таблице 1, для одного трансфекции единицы. Если более колбах или блюда используются для трансфекции, отрегулировать объемы соответственно.
    4. Добавить ДНК-кальциевый раствор в трубке B в трубку в каплям, сохраняя при этом постоянную и нежный перемешивания в вихре. Пусть смесь сидеть при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Ключ для успешной трансфекции фосфатом кальция зависит от размера и формы осадок. Таким образом, смесь следует перемешать постоянно и медленно, чтобы выполнить это требование, и, как результат, повышение эффективности трансфекции.
    5. Добавить в смесь по каплям и даже образом в клетках 293T (4000 мкл / флакон). Культуры клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С в 5% СО 2.
    6. Замените культуральной среде со свежей бессывороточной OPTI-MEM я уменьшенного сыворотки среднего (50 мл / флакон) 8-10 ч после трансфекции. Продолжайте культуры клеток в течение еще двух дней в том же состоянии.
    7. Сбор супернатант, содержащий выразил rRBD белка 72 ч после трансфекции. Центрифуга при 6000 оборотов в минуту в течение 15 минут, чтобы удалить ячейку мусора. Добавить коктейль ингибиторов протеаз, чтобы собранные супернатант и хранить при температуре 4 ° С в течение ночи.
    8. На следующий день, очищают rRBD рекомбинантного белка из супернатанта культуры, используя инструкции Ni-NTA Superflow следующие производителя.
    9. Концентрат очищенный белок использованием Amicon Ультра труб -15 концентрации. После концентрации белка,добавить PBS с концентрацией труб и центрифуга снова, чтобы удалить имидазола в элюции буфера. Рассчитайте концентрации белка и хранить очищенный белок при температуре -80 ° С до использования.

2. Иммунизация мышей и взятием проб

  1. Предварительно теплой Sigma адъювантной системы (SAS) до 40-45 ° С в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте 1 мл PBS на флакон и тщательно перемешать.
  2. Подготовка белка адъювантной эмульсии в соответствии с протоколом в таблице 2. Внесите рассчитывается rRBD белка в 1,5 мл трубки. Добавить равный объем SAS адъювантной к трубке и вихревые энергично в течение 2-3 мин с образованием эмульсии.
    Подсказка: объемы перечисленных в таблице 2 для одной мыши. Отрегулируйте объемах в соответствии с фактической численности мыши используется. Для каждой группы, смешать белки и адъювантной необходимых для каждой вакцины. Всегда готовьте один дополнительный образец для вакцинации для обеспечения точности.
    Группа 1-й вакцины
    (200 мкл / мышь)     		2-й вакцины
    (200 мкл / мышь)     		3-й вакцины
    (200 мкл / мышь)
    rRBD белка 20 мкг белка в PBS
    (100 мкл) + 100 мкл SAS     		10 мкг белка в PBS (100 мкл) + 100 мкл SAS 10 мкг белка в PBS (100 мкл) + 100 мкл SAS
    PBS контроль 100 мкл PBS +
    100 мкл SAS     		100 мкл PBS +
    100 мкл SAS     		100 мкл PBS +
    100 мкл SAS
    Таблица 2. Мышь иммунизации протокола
  3. Подкожно премьер-иммунизации женщин BALB / с мышами (4-6 недель, 5 мышей / группу), и увеличить в два раза с rRBD и SAS, как указано в таблице 2. Используйте PBS группе контроля. Сайт для подкожных инъекций обычно выбирают является свободной кожи между лопатками. Кроме того, вентральной брюшной полости обычно используется, потому что это легче внедрить, и может наблюдать любой утечки из места инъекций. При повторных доз вакцины используются, легко выбирать различные сайты инъекции, предотвращая потенциальные местные кожные реакции.
  4. Bleed мышей через ретроорбитального с анестезией до иммунизации и через 10 дней после каждой вакцинации и сывороток тепла при 56 ° С в течение 30 мин для инактивации комплемента. Магазин мыши сыворотки при температуре -20 ° С до использования.

3. Нейтрализация Обнаружение использованием Пробирной Pseudovirus Нейтрализация

  1. Подготовка ОРВИ pseudovirus
    1. Сплит 293T клеток в 100 мм культуре ткани чашках Петри (2х10 6 кл / блюдо) 16 часов до трансфекции, и растут клетки как указано выше.
    2. Подготовка реагентов трансфекции, как указано в таблице 1. Сотрудничество трансфекции плазмидой, кодирующей SARS-коронавирус S белка и плазмиды, кодирующей ENV-неисправен, люциферазы, экспрессирующих ВИЧ-1 генома (pNL4-3.luc.RE) с помощью фосфата кальция трансфекции реагента.
    3. Замените среду с 10 мл свежей DMEM, содержащей 10% FBS и 1% P / S 8-10 ч после трансфекции. Сбор супернатант, содержащий ОРВИ pseudovirus 72 ч после трансфекции.
    4. Фильтры pseudovirus через 0,45 мкм фильтр. Алиготе и хранить при температуре -80 ° С до использования.
  2. Атипичной пневмонии pseudovirus нейтрализации анализа
    1. Сплит 293T клеток, экспрессирующих SARS-коронавирус рецепторов ACE2 (ACE2/293T) на 10 4 cells/100 мкл / лунку в 96-луночных культуры тканей 16 ч до заражения.
    2. Развести ОРВИ pseudovirus по 2-кратный для обнаружения титра вируса в ACE2/293T клеток.
    3. Серийно разбавленный мыши сывороток в 96-луночных культуре тканей, а также добавить равный объем титруемой pseudovirus атипичной пневмонии. Preincubate пластин при 37 ° С в течение 1 ч.
    4. После инкубации, добавьте 100 мкл сыворотки-pseudovirus смеси ACE2/293T клеток, и продолжают расти клетки при 37 ° С в 5% СО 2. Добавьте свежие DMEM 24 часов спустя.
    5. Полностью удалить культуры супернатантов из пластин 72 ч после заражения. Добавить 1X люциферазы культуре клеток лизис реагента (60 мкл / лунку), а также содействовать лизиса клеток с постоянной тряски пластин в течение 1-2 ч при комнатной температуре.
    6. Передача клеточных лизатов (50 мкл / лунку) в люминометра пластин (Microfluor 96-луночных планшетах). Добавить люциферазы подложки (50 мкл / лунку), включенных в люциферазы системы анализа и выявления относительной активности люциферазы в Ультра 384 люминометра.
    7. Рассчитать ОРВИ pseudovirus титр нейтрализации и присутствует в виде 50% нейтрализации титр антител (NT 50) 6.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Плотность клеток является важным фактором, влияющим на эффективность фосфата кальция основе трансфекции. По нашему опыту, менее 70% слияния клеток приносит лучшие результаты. Таким образом, для того, чтобы улучшить эффективность трансфекции, рекомендуется, чтобы плотность клеток быть на уровне около 50-70% от слияния. Трансфекции фосфатом кальция метод обычно считается менее эффективным по сравнению с другими методами трансфекции, таких как липидные трансфекции 16. Тем не менее, в этом протоколе, мы использовали модифицированный фосфата кальция трансфекции метод, посредством постоянного и медленно смешивания трансфекции решение в вихрь обеспечивает формирование осадка с соответствующего размера и формы, тем самым повышая эффективность трансфекции.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH) в США (RO1 AI68002).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NaClSigma-AldrichS7653
Na2HPO4*7H2OSigma-AldrichS2429
HEPESSigma-AldrichH3375
CaCl2*2H2OSigma-AldrichC5080
DMEMInvitrogen12430
HI FBSInvitrogen10438
Пенициллин/стрептомицинInvitrogen15140
Среда OPTI-MEM IInvitrogen31985
Коктейль ингибиторов протеазRoche Group11836170001
Ni-NTA SuperflowQiagen30450
Система адъювантов SigmaSigma-AldrichS6322
Система анализа люциферазыPromega Corp.E1501
Реагент для лизиса культур клеток для анализа люциферазы (5X)Promega Corp.E1531
Amicon Ultra - 15EMD MilliporeUFC901024
Микрофлуоресцентные 96-луночные планшетыThermo Fisher Scientific, Inc.7905
Люминометр Ultra 384Tecan Group Ltd.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).
  2. Tait, A., Hall, F. R. Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines. Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).
  3. Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270. Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).
  4. Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
  5. Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).
  6. Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity. Virology. 393, 144-150 (2009).
  7. Ambrosino, D. M. Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor. J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).
  8. Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 426, 450-454 (2003).
  9. He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).
  10. Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection. Gene. 270, 61-68 (2001).
  11. Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents. BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).
  12. Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
  13. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
  14. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  15. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, 140-149 (2004).
  16. Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SARSRBDACE2

Похожие статьи