Модель параллельного потока пластин in vitro для изучения бактериальной адгезии на биопсии ткани

Аннотация

Источник: Дитковски, Б. и др. Модель in vitro параллельной пластинной перфузионной системы для изучения прикрепления бактерий к пересадившимся тканям. J. Vis. Exp . (2019).

В этом видео демонстрируется метод использования параллельной пластинчатой камеры для проникновения флуоресцентно маркированных бактерий на ткани сосудистого трансплантата, что позволяет проводить контролируемый анализ бактериальной адгезии и раннего патогенеза в условиях сдвига потока.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и утверждены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.1. Эксперименты по перфузии in vitro с использованием камеры параллельных пластин

1. Биопсии тканей диаметром 10 мм и такой же толщины установят в систему потоковой камеры с внутренней поверхностью, направленной вверх, чтобы контактировать с бактериальной суспензией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одинаковая толщина ткани на разных трансплантатах обеспечивает достижение одинаковой высоты ткани в канале, что позволяет ламинарному течению при любых условиях. Все элементы камеры потока представлены и описаны на рисунке 1.
   1. Для начала протокола поместите круглую ткань между стеклом микроскопа с круглой перфорацией диаметром 8 мм и резиновой прокладкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскопический затвор имеет ультратонкую нижнюю плёнку, позволяющую создавать отверстие диаметром 8 мм. Вместе с резиновым листом он фиксирует ткань, обеспечивая прямой контакт между образцом и текущей средой, а также предотвращает вывих биопсии во время эксперимента. Поверхность исследуемой ткани, подвергающаяся воздействию потока (меньшего диаметра), не может быть изменена щипцами.
      1. Вставьте держатель с тканью в прокладку, встроенную в нижний металлический каркас камеры.
      2. Прикрепите верхнюю металлическую раму с соответствующим прокладочным листом к нижней части камеры с ранее вставленным держателем для салфетки. Затем закрепите всю камеру восемью винтами и гайками. Убедитесь, что высота камеры всегда одинакова между трансплантатами.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Высота патронника должна определяться всегда после затягивания винтов. Используйте суппорт или линейку.
2. Соедините камеру потока с перистальтическим насосом, а резервуар жидкости — с трубками.
3. Перфузия тканей с суспензиями 10⁷ CFU/mL (подтверждено подсчётом CFU (колониообразующая единица) и связанной с_{OD 600} (оптическая плотность)), флуоресцентно маркированных бактерий в PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор) с сдвиговым напряжением 3 дайна/^{см² (} дайн на квадратный сантиметр единицы давления) с помощью перистальтического насоса (расход 4 мл/мин) в течение 1 часа с использованием бактериального резервуара объёмом 400 мл (внутренняя конструкция, Рисунок 1) кондиционируется при 37 °C с помощью пластинчатого термостата (Таблица материалов).
4. Непрерывно циркулируйте бактериальную суспензию объёмом 100 мл, используя тот же резервуар.
5. После перфузии разберите камеру, чтобы освободить трансплантат, и промыйте ткань дважды с помощью 4 мл PBS в пластине на 12 лунок с помощью лабораторного орбитального шейкера по 3 минуты каждая. Затем разрезают внутреннюю часть трансплантата с помощью биопсии кожи меньшего диаметра.
6. Поместите каждую биопсию ткани в отдельную трубку объёмом 14 мл, содержащую 1 мл стерильного содержания 0,9% NaCl. Пометьте трубку как #1.
7. Отдельте бактерии от ткани с помощью звуковой ванны в течение 10 минут (амплитуда = 100% и частота = 45 кГц).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полное отделение бактерий от тканевых трансплантатов следует оценивать при инкубации пластырей ночью при 37 °C в жидкой среде TSB (триптический соевый бульон), после чего проводятся измерения_{OD 600} по сравнению с контрольными пластырями, обработанными раствором без бактерий.

Результаты

Рисунок 1: Изображение недавно разработанной системы камер потока (внутренняя конструкция). A. Камера потока (1) установленный набора потока размерами LxWxH: 125 мм x 55 мм x 18 мм (винты в сочетании с гайками удерживают части камеры вместе...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пластырь для перикарда крупного рогатого рода (BP), мягкий пери-гард перикард	Synovis Surgical Innovations, США	PC-0404SN
Трубопроводы для яремных венов крупного рогатого рогатого рог	Contegra Contuit; Medtronic Inc, США	M333105D001
CH криоконсервированный гомографт	Европейский банк гомотрансплантации (EHB)	-
Acu-Punch	Acuderm Inc, США	P850 (8 мм); P1050 (10 мм)
Человеческий альбумин	Флексбумин; Бакстер, Бельгия	BE171464LOT:16G12C
Триптический соевый бульон (TSB)	Флука, Штайнхайм, Германия	22092-500G
Инфузионный бульон для сердца (BHI)	Fluka	53286-500G
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).	Gibco	14190-094
5(6)-Карбоксифлуоресцеин N-гидроксисукцинимид эфир (CF)	Сигма-Альдрих, Германия	21878-100MG-F
Перистальтический насос (МОДЕЛЬ ISM444B)	Ismatec BVP-Z Standard; Коул Пармер, Вертхайм, Германия	631942-2
Соникационная ванна	Ультразвуковой очиститель VWR; VWR, Раднор, Пенсильвания	142-6044	230 В/50 -60 Гц 60VA; HF45 кГц, 30 Вт
ProLong Gold Антифейд Монтант	Инвитроген от ThermoFisher	P36930
Arium Pro VF — ультрачистая вода — H2O MilliQ	Миллипор	87206462
Микроскопические слайды — камеры для культуры тканей (1-колодца)	Сарштедт	94.6140.102
1-колодец на съёмном Lumox	Сарштедт	94.6150.101
Нержавеющая сталь — хирургические лезвия	Свонн-Мортон	311
Силиконовая трубка Tygon, 1/8"ID x 1/4"OD	Коул-Пармер	EW-95702-06	Температурный диапазон: –80–200°C Стерилилизировать: с помощью этиленоксида, гамма-облучения или автоклава на 30 минут, давление 15 psi
Трубка PharMed BPT	Сен-Гобен	AY242012	Автоклав 30 минут при 121°C
Труба Tygon LMT-55	Saint Gobain Performance Plastics™	15312022
Термостат	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230 В, 90 ВА, 50 Гц