Оценка специфичности мишеней микроРНК: анализ распространения вируса с использованием синтетических имитаторов микроРНК ПРИМЕЧАНИЕ: Использование синтетического имитатора микроРНК проводится для подтверждения специфичности взаимодействия между микроРНК и ее мишенью. Чтобы оценить токсичность, опосредованную микроРНК, в каждом анализе следует использовать контроли с имитацией трансфекции (mock), отрицательный контрольный имитатор микроРНК и только экспериментальный имитатор микроРНК. Также желательно включить положительный контроль (например, ген или геном, являющийся мишенью для микроРНК), поскольку низкая эффективность трансфекции имитаторов микроРНК может привести к ложноотрицательным результатам. Рассейте клетки H1-HeLa в 96-луночный планшет для культивирования тканей таким образом, чтобы к моменту трансфекции (через 24 ч после посева) они достигли 80–90% конфлюэнтности. Рассейте клетки в среде DMEM (модифицированная игла среда Дульбекко), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, из расчета 0,1 мл на лунку. ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите данный анализ на клетках, пермиссивных к репликации вируса, которые не экспрессируют когнатные микроРНК. Доведите реагенты для трансфекции до комнатной температуры. Смешайте 9 мкл безсывороточной среды, сток имитатора микроРНК (для конечной концентрации 200 нМ на лунку), 0,18 мкл бустер-реагента и 0,18 мкл реагента для трансфекции. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 2–5 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные объемы приведены для одной лунки. Для обеспечения единообразия и минимизации ошибок пипетирования рекомендуется готовить общую смесь (master mix) для трансфекции всех лунок. Оптимальная концентрация имитатора микроРНК может варьироваться. Ознакомьтесь с инструкциями производителя имитатора микроРНК для выбора подходящей начальной концентрации; обычно она составляет от 5 до 200 нМ в конечном объеме. Аспирируйте среду из лунок и добавьте 92 мкл свежей полной среды. ПРИМЕЧАНИЕ: При большом количестве образцов выполните этот шаг до приготовления раствора для трансфекции и храните планшет при 37 °C до начала работы. Покапельно добавьте всю смесь для трансфекции к клеткам. Инкубируйте при 37 °C в течение 6 ч. Заразите каждую лунку при низкой MOI (множественности заражения), чтобы была инфицирована лишь небольшая часть клеток, что позволит проанализировать распространение вируса. В данном протоколе используется MOI = 0,2. Разведите стоки вируса в безсывороточной среде до концентрации MOI = 0,2 на 100 мкл. Удалите среду из лунок и добавьте по 100 мкл разведения вируса в каждую лунку. Инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч. Аспирируйте среду из каждой лунки и добавьте 100 мкл свежей полной среды. Инкубируйте при 37 °C в течение 20–22 ч. Определите титр вируса в супернатантах. Соберите супернатант из каждой лунки и замените его 100 мкл свежей полной среды. ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании суспензионных клеток ресуспендируйте клеточный осадок, полученный на следующем этапе, в 100 мкл свежей полной среды и верните его в лунку с образцом для анализа жизнеспособности. Удалите клеточный дебрис из собранных супернатантов путем центрифугирования при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Перенесите очищенный супернатант в новую пробирку и определите титр инфекционного вируса на пермиссивных клетках, не экспрессирующих когнатные микроРНК. ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все образцы на льду, чтобы предотвратить потерю инфекционности. Ruiz, A. J. and Russell, S. J. Регуляция тропизма пикорнавирусов на основе микроРНК. J. Vis. Exp. (2017)
В данном видео демонстрируется использование синтетических имитаторов микроРНК для селективного ингибирования репликации вируса в культивируемых эпителиоподобных клетках. Показано, как сайленсинг генома, направляемый микроРНК, может блокировать распространение вируса, а специфичность таргетинга подтверждается последующим анализом инфекционности.
