Производство и сбор терапевтических эпителиальных клеток, продуцирующих вирус

Аннотация

Определение репликативной и цитотоксической способности вирусных векторов, кодирующих иммуномодуляторы Сравните кинетику репликации полученного рекомбинантного вируса и немодифицированного вектора с помощью одноступенчатых или многоступенчатых кривых роста (КР). При одноступенчатых КР оценивается вирусное потомство после одновременного заражения всех клеток (теоретически 100% инфицирование). Многоступенчатые КР начинаются с низкого процента инфицированных клеток, чтобы проследить за несколькими циклами репликации вируса. Для анализа кинетики репликации вируса кори за один день до заражения высейте 1 x 10⁵ клеток Vero в 1 мл DMEM (модифицированной среды Игла в модификации Дальбеко) с 10% FBS (фетальной бычьей сыворотки) на лунку в 12-луночных планшетах. Для каждой интересующей временной точки используйте как минимум две лунки в качестве технических повторностей. Заразите клетки вирусом с низкой MOI (множественностью заражения) для многоступенчатых или с высокой MOI для одноступенчатых КР (для вируса кори (MV) на клетках Vero MOI составляют 0,03 и 3 соответственно). Замените среду на 300 мкл безсывороточной среды, содержащей соответствующее количество вируса, и инкубируйте при 37 °C и 5% CO₂ не менее 2 ч. Удалите инокулят, добавьте 1 мл DMEM с 10% FBS и продолжите инкубацию. В соответствующие временные точки (например, через 12, 24, 36, 48, 72 и 96 ч после заражения) соберите вирусное потомство, непосредственно соскребая клетки в среду. Перенесите содержимое каждой лунки в отдельную пробирку, мгновенно заморозьте в жидком азоте и храните при -80 °C до проведения титрования. ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе параллельные образцы могут быть объединены для анализа средних титров. Соберите образцы за все временные точки. Разморозьте их одновременно при 37 °C для оценки вирусного потомства. Перемешайте на вортексе и осадите клеточный дебрис путем центрифугирования в течение 5 мин при 2 500 x g и 4 °C. Рассчитайте средние титры для каждого конструкта и временной точки, как описано выше. Постройте график зависимости титров от времени. Сравните кривые роста векторов с вставленными и без вставленных трансгенов, с разными трансгенами или с трансгенами, вставленными в разные позиции (см. Рисунок 1). Heidbuechel, J. P., и др.Парамиксовирусы для таргетной иммуномодуляции опухолей: дизайн и оценка ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).

В данном видео демонстрируется процесс инфицирования эпителиальных клеток почек генетически модифицированными вирусами для их получения и последующего сбора с целью изучения репликации вирусов.

Протокол

1. Определение репликативной и цитотоксической способности вирусных векторов, кодирующих иммуномодуляторы

Сравните кинетику репликации полученного рекомбинантного вируса и немодифицированного вектора с помощью одноступенчатых или многоступенчатых кривых роста (КР). Для одноступенчатых КР оценка вирусного потомства проводится после одновременного заражения всех клеток (теоретически 100% инфекция). Многоступенчатые КР начинаются с низкого процента зараженных клеток, чтобы проследить за несколькими раундами репликации вируса.

1. Для анализа кинетики репликации вируса кори за один день до инфицирования высейте 1 x 10⁵ клеток Vero в 1 mL DMEM (модифицированной среды Игла в модификации Дульбекко) с 10% FBS (фетальной бычьей сыворотки) на каждую лунку 12-луночного планшета. Для каждой интересующей временной точки используйте не менее двух лунок в качестве технических повторов.
2. Инфицируйте клетки вирусом с низкой MOI (множественностью заражения) для многоступенчатых или с высокой MOI для одноступенчатых кривых роста (КР) (0,03 и 3 для MV или вируса кори, соответственно) при репликации на клетках Vero. Замените среду на 300 µL безсывороточной среды, содержащей соответствующее количество вируса, и инкубируйте при 37 °C и 5% CO₂ в течение не менее 2 ч. Удалите инокулят, добавьте 1 mL DMEM с 10% FBS и продолжите инкубацию.
3. В соответствующие временные точки, такие как 12, 24, 36, 48, 72 и 96 ч после инфицирования, соберите потомство вируса путем прямого соскребания клеток в среду. Перенесите содержимое каждой лунки в отдельную пробирку, подвергните мгновенной заморозке в жидком азоте и храните при -80 °C до проведения титрования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе повторные образцы могут быть объединены для анализа средних титров.
4. Соберите образцы за все временные точки. Разморозьте их одновременно при 37 °C для оценки потомства вируса. Перемешайте на вортексе и осадите клеточный дебрис путем центрифугирования в течение 5 мин при 2,500 x g и 4 °C.
5. Рассчитайте средние титры для каждого конструкта и временной точки, как описано выше. Постройте график изменения титров во времени. Сравните кривые роста векторов с вставленными и без вставленных трансгенов, с различными трансгенами или с трансгенами, вставленными в разные позиции (см. Рисунок 1).

Результаты

Рисунок 1: Кинетика репликации и литическая активность рекомбинантных вирусов кори. (A) Одноступенчатые кривые роста были построены после инфицирования клеток Vero немодифицированным онколитическим вирусом кори (MV) или вирусом кори, кодирующим биспецифический активатор Т-клеток (MV-H-mCD3xhCD20), при MOI 1. Титры вирусного потомства оценивали в заданные моменты времени после инфицирования, что указало на схожую кинетику репликации вирусов. Показаны средние значения и стандартные отклонения для восьми образцов (по четыре технических повтора для двух биологических повторов в каждой временной точке). (B>) Жизнеспособность клеток оценивали на клетках колоректальной карциномы мыши MC38, стабильно экспрессирующих человеческий кациноэмбриональный антиген и рецептор вируса кори CD46 (MC38-CEA-CD46), после инокуляции только средой (mock) или указанными вирусами при MOI 1. Тест XTT на жизнеспособность клеток проводили в указанные моменты времени. Снижение жизнеспособности клеток наблюдалось в более ранние временные точки для немодифицированного вектора. Значения более 100%, рассчитанные для MV-H-mCD3xhCD20 через 12 ч, часто наблюдаются вскоре после инфицирования, что может быть связано с клеточным стрессом или факторами клеточного происхождения, присутствующими в вирусной суспензии. Для каждой временной точки показаны средние значения плюс стандартные отклонения трех технических повторов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021	Используется для посева и инфицирования клеток Vero
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500	Для дополнения среды DMEM
Клетки Vero	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81	Клетки-хозяева для размножения и анализа вируса кори
12-луночные планшеты	Neolab, Heidelberg, Germany	353043	Для посева клеток Vero (1 × 10⁵ на лунку)
Opti-MEM (безсывороточная среда)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	31985070	Для этапа инфицирования вирусом (инкубация без сыворотки)
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	14190-094	Для промывки и приготовления среды
Скребер для клеток	Corning, Reynosa, Mexico	3008	Используется для соскабливания инфицированных клеток при сборе
Пробирки 50 мл	nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany	02-572-3001	Для сбора образцов и центрифугирования
Жидкий азот	—	—	Для мгновенного замораживания собранных вирусных образцов
Центрифуга (с возможностью достижения 2,500 × g)	—	—	Для осаждения клеточного дебриса
XTT Cell Viability Kit (Colorimetric Cell Viability Kit III)	PromoKine, Heidelberg, Germany	PK-CA20-300-1000	Включает XTT-реагент; для измерения цитотоксичности
96-луночные планшеты с плоским дном	Neolab, Heidelberg, Germany	353072	Для измерения абсорбции при 450 nm
Спектрофотометр / Ридер для микропланшетов	—	—	Для измерения оптической плотности при 450 nm (референс 630 nm)
CO₂-инкубатор	—	—	37 °C, 5% CO₂ для всех инкубаций клеток