Оценка иммунологической функциональности изолированных иммуномодуляторов. Ниже подробно описан способ оценки индуцированной биспецифическими активаторами Т-клеток (BTE) клеточно-опосредованной цитотоксичности с помощью анализа высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Определите условия, которые будут тестироваться в ходе эксперимента (см. рисунок 1 в качестве примера). Могут варьироваться временные точки (от часов до дней), концентрации иммуномодулятора (от пг/мл до мкг/мл) и соотношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням (E:T) (например, от 1:50 до 50:1). Всегда готовьте образцы в трех повторностях. Включите образцы без белка BTE и без эффекторных клеток, контроли спонтанного высвобождения ЛДГ для отдельных типов клеток (Tsp и Esp), контроль максимального лизиса клеток-мишеней (Tmax) с добавлением детергента перед считыванием, контроль только со средой и контроль объема для Tmax. ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемое количество клеток-мишеней и время инкубации могут варьироваться. Проведите предварительные тестовые прогоны без эффекторных клеток и иммуномодуляторов для определения оптимальных параметров. Включите образцы Tsp и Tmax и соответствующие контроли для оценки различных количеств клеток и временных точек. Изолируйте иммунные эффекторные клетки (например, путем центрифугирования крови человека в градиенте плотности для получения мононуклеарных клеток периферической крови (МНКПК) или путем негативной селекции Т-клеток мыши из спленоцитов мыши). Рассейте клетки-мишени (например, 5 x 10³ на лунку) в 96-луночный планшет с U-образным дном. Добавьте изолированный белок в желаемых концентрациях в соответствующие образцы. Добавьте иммунные эффекторные клетки в желаемых соотношениях. Добавьте среду до достижения общего объема 100 мкЛ на лунку. Инкубируйте в течение установленного периода времени, обычно от 4 до 48 ч (24 ч для нестимулированных МНКПК и 48 ч для свежеизолированных Т-клеток мыши; для предварительно стимулированных иммунных клеток может применяться более короткое время инкубации) при 37 °C и 5% CO2. За 45 минут до сбора образцов добавьте 10 мкЛ 10-кратного раствора для лизиса в лунки, содержащие образцы Tmax, и в соответствующие контроли со средой. Продолжите инкубацию. Осадите клетки центрифугированием при 250 x g в течение 4 мин. Перенесите 50 мкЛ каждого супернатанта в 96-луночный планшет с плоским дном. Не переносите клетки, чтобы избежать попадания связанной с клетками ЛДГ. Приготовьте раствор субстрата согласно инструкциям производителя. Добавьте по 50 мкЛ в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре [RT] в темноте в течение 30 мин или до тех пор, пока образцы Tmax не станут темно-красными. Добавьте 50 мкЛ стоп-раствора в каждую лунку. Удалите пузырьки воздуха путем центрифугирования в течение 1 мин при 4,000 x g и вручную с помощью полой иглы. Измерьте оптическую плотность при 490 нм. Рассчитайте значения % специфического лизиса для каждого образца. Рассчитайте средние значения для повторностей контролей со средой с раствором для лизиса и без него. Вычтите полученные значения из показателей экспериментальных образцов, а также из контролей Tmax и спонтанного высвобождения соответственно. Используйте эти скорректированные по фону значения для дальнейших расчетов. Рассчитайте средние значения для скорректированных по фону контролей Tmax, Tsp и Esp. С использованием этих средних значений следующее уравнение позволяет определить процент специфического лизиса для каждого образца: Постройте график зависимости значений % специфического лизиса от концентрации белка или соотношения E:T и сравните их с контрольными образцами без воздействия. Хайдбюхель, Дж. П., и др.Парамиксовирусы для таргетной иммуномодуляции опухолей: разработка и оценка ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).
В данном видео демонстрируется клеточный анализ для оценки таргетно-специфической иммуномодулирующей активности вирусного биспецифического активатора Т-клеток (BTE). BTE связывает опухолевые клетки, экспрессирующие таргетный рецептор, с Т-клетками, что вызывает лизис опухоли и высвобождение ферментов. Колориметрический метод считывания, основанный на конверсии субстрата, указывает на активацию Т-клеток. Более высокая интенсивность окраски в исследуемом образце подтверждает специфическое иммунное взаимодействие с рецептором, опосредованное BTE.
