Определение инфекционности РНК и выхода вируса Культивируйте клетки BHK-21 (почки младенца хомяка) в чашках для культивирования диаметром 150 мм с плотностью 3 × 10⁶ клеток на чашку в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2. ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте клетки BHK-21 в среде alpha-MEM (минимальная эссенциальная среда альфа) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, витаминов и пенициллина/стрептомицина. Промойте монослой клеток 10 мл холодного раствора А (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na2HPO4 и 1,5 мМ KH2PO4). Отделите клетки от чашек, обработав их 4 мл раствора трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0,25%), и соберите их путем центрифугирования в настольной центрифуге при 270 × g в течение 2 мин. Ресуспендируйте клеточный осадок в 50 мл холодного раствора А в коническом пробирке объемом 50 мл и центрифугируйте клеточную суспензию при 270 × g в течение 2 мин. Повторите процедуру промывки трижды; после последней промывки ресуспендируйте клеточный осадок в растворе А до плотности 2 × 10⁷ клеток/мл. Смешайте аликвоту 400 мкл клеточной суспензии с 2 мкг синтетической РНК в кювете с зазором 2 мм и немедленно подвергните смесь электропорации с помощью электропоратора при оптимальных условиях: 980 В, длительность импульса 99 мкс, 5 импульсов (рисунок 1C). Выдержите электропорированные клетки при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин, затем перенесите их в микропробирку объемом 1,7 мл, содержащую 600 мкл полной культуральной среды. Приготовьте 10-кратные серийные разведения электропорированных клеток в 1 мл полной культуральной среды и высейте аликвоту 100 мкл каждого разведения на монослои неэлектропорированных клеток BHK-21 (5 × 10⁵) в 6-луночном планшете. После 4–6 ч инкубации покройте клетки 0,5% агарозой в минимальной эссенциальной среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Инкубируйте планшеты в течение 4 дней при 37 °C и 5% CO2. Визуализируйте инфекционные центры (бляшки) путем фиксации 7% формальдегидом и окрашивания 1% кристаллическим фиолетовым в 5% этаноле (рисунок 2A). Дополнительно: исследуйте клетки после электропорации РНК через 18–20 ч после трансфекции на экспрессию белков вируса японского энцефалита (JEV) с помощью иммунофлуоресцентного анализа (рисунок 2B), и соберите супернатанты электропорированных клеток через 22 и 40 ч после трансфекции для титрования вируса методом анализа бляшек (рисунок 2C). Юн С. и др.Бактериальные искусственные хромосомы: инструмент функциональной геномики для изучения РНК-вирусов с положительной полярностью. J. Vis. Exp. (2015)
В данном видео демонстрируется восстановление инфекционного вируса японского энцефалита из синтетической РНК, транскрибированной из клона бактериальной искусственной хромосомы. Показано, как проводится электропорация клеток синтетической РНК, что позволяет вирусному геному направлять продукцию новых вирионов. Образовавшиеся в результате бляшки в монослоях инфицированных клеток подтверждают успешное восстановление инфекционного вируса.
