Изоляция мышей Островок поджелудочной железы

Протокол

Подготовка Коллагеназа

1. Отвешивать коллагеназы в 50 мл конические и добавить изоляции буфера, чтобы конечная концентрация, как указано в таблице ниже. Растворите коллагеназы на вортексе.
   
   
   (12 мышей + 2 дополнительных мышей = 14 мышей х 5 мл / мышь = 70 мл полное решение коллагеназы)
   
   
   (70 мл х 0,5 мг / мл или 0,3 мг / мл = 35 мг или 21 мг общего коллагеназы Р)
   
   
   

   Напряжение	Возраст	Коллагеназа Р (мг / мл)	Время (мин)
   C3H, Balb / С, В6	> 12 недель	0,8	17
   C3H, Balb / С, В6	<= 12 недель	0,5	13
   NOD, NOR, ОТСУТСТВИЯ	> 12 недель	0,8	17
   NOD, NOR, ОТСУТСТВИЯ	<= 12 недель	0,5	17

   
   
   
2. Внесите 2 мл коллагеназы раствора в каждую ампулу стекла и место на льду. Нагрузка каждого 5-мл шприц 3 мл коллагеназы добавить иглой 30g и место в лед (подготовка в капот).

Растяжение

1. Незадолго до вскрытия, жертву животного шейки дислокации. Спрей всего тела с 70% этанола, что делает его совершенно мокрый. Сделать V-insision, начиная с области половых органов. Поверните мышь так хвост отворачивается от вас.
2. Удалить кишечника в левой части открытой мыши. Это выставит поджелудочной железы и общего желчного протока.
3. Место кровоостанавливающего зажима на обе стороны тонкой кишки, где желчных протоков стоков, оставляя небольшой карман для коллагеназы решение войти в кишечнике.
4. Inflate поджелудочной железы через желчный проток с иглой 30g и 5 мл шприц, содержащий 3 мл холодного раствора коллагеназы, начиная с желчным пузырем.
5. Удаление поджелудочной железы из тела и поместить его в силиконизированный флакон с 2 мл коллагеназы решение. Этот шаг должен быть сделан быстро и чисто, как это возможно, сведения к минимуму сбор жира и соединительной ткани.
6. Место флакон на льду и повторите шаг 3 со следующей мыши.

Пищеварение

1. Печать каждого флакона и поместить его в 37 ° С водяной бане. Инкубируйте 13-17 минут (время варьируется в зависимости от штамма и возраста животного).
2. После истечения времени, встряхнуть флакон энергично. Поджелудочной железы должны разваливаться.
3. Залить каждую переварить через большую стерильной фильтр погрузиться в стерильную 1000 мл стакан и с силой пипетки с экрана промывочным раствором. Внесите дайджесты в 50 мл пробирки conicals (3 pancreata/50 мл трубки: при п = 12, достаточно использовать промывочный буфер, чтобы сделать окончательный объем 200 мл и отказаться от ее 4x50 мл пробирки). Разбавление должно быть сделано быстро и на льду, чтобы избежать нежелательных пищеварения островок.
4. Спином вниз: Пуск центрифуги. Когда она достигает 1300 оборотов в минуту, выключить его.
5. Аспирируйте супернатант, оставив ~ 5 мл. Будьте очень осторожны, чтобы не аспирата гранул.
6. Ресуспендируют гранул, нажав энергично рукой, а затем добавить 50 мл промывочного буфера.
7. Спином вниз: Пуск центрифуги. Когда она достигает 1300 оборотов в минуту, выключить его.
8. Ресуспендируют шарик и промыть 5 мл промывочного буфера.
9. Передача 5 мл до 15 мл конические и спином вниз, как указано выше.
10. Аспирируйте супернатант как можно более полно. (Оставшееся буфера может привести к изменению плотности Ficoll.)

Ficoll

Выполнить быстро. Долгосрочные Ficoll экспозиции является токсичным для островков.

1. Убедитесь, что гранулы полностью разбит перед добавлением Ficoll (непрерывную ткань трудно ресуспендируют в Ficoll).
2. Ресуспендируют гранул в 7 мл Ficoll, плотность 1,108, по вортексе энергично.
3. Слой друг на плотность Ficoll 2 мл каждого из оставшихся плотности в таком порядке: 1,096, 1,069, то 1,037.
4. Спиновые в течение 15 минут при 1800 оборотов в минуту на 4 градуса, с перерывом OFF!
5. Выберите островки из второй слой с помощью spoid (стерильный рlastic пипетки). Передача всех коллекций в 50 мл конические, содержащей ~ 25 мл холодного буфера.
6. Вымойте, как и выше, в 3 раза промывочным буфером (повторив шаг 12-15).
7. Ресуспендируют островков в 20 мл RPMI-1640 (содержащей 10% FCS и пенициллин и стрептомицин, HEPES, MEM-NEAA) и аккуратно перемешать. Удалить 100 мкл образца для подсчета голосов.
8. Передача 100 мкл до 35 мм грид-пластину, содержащую 1 мл среды и 1 мл дитизоном.
9. Инкубируйте оставшиеся островки в RPMI 1640 году, в 37 ° C, 7% СО ₂ инкубатора, в 160 мм пластин с в общей сложности 30 мл среды / пластину.