Методическая статья

Finger-палки забора крови Методология определения Упражнение вызванных лимфоцитов Апоптоз

DOI:

10.3791/2595

⸱

24 февраля 2011 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Kinesiology, Recreation, and Sport, Western Kentucky University, 2Department of Health and Human Performance, University of Houston

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Физические упражнения способны индуцировать апоптоз клеток иммунной системы. Существуют различные ограничения измерения, особенно в отношении количества времени, необходимого для изоляции и лечения крови до проведения оценки. Продемонстрированный является быстрым и минимально инвазивные процедуры для анализа упражнения-индуцированного апоптоза лимфоцитов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Упражнение физиологические стимулы способны вызывать апоптоз клеток иммунной системы. На сегодняшний день различные ограничения были выявлены с измерением этого явления, особенно в отношении количества времени, необходимого для изоляции и лечения крови до оценку гибели клеток. Из-за этого, трудно определить, является ли сообщили об увеличении апоптоза клеток иммунной могут быть внесены в реальный эффект физических упражнений на системы, или являются отражением времени и обработки необходимо получить в конечном итоге это измерение. В этой статье мы демонстрируем быстрое и минимально инвазивные процедуры для анализа вызванная осуществлением лимфоцитов апоптоза. В отличие от других методов, цельной крови добавляют антитела панели сразу же после получения образца. После инкубационного периода, красные кровяные клетки лизируются и образцы готовы для анализа. Использование пальца придерживаться процедуры отбора образцов, уменьшает объем крови необходимо, и свести к минимуму неудобства для предметов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Finger-Stick забора крови

  1. Коллекция цельной крови, как правило, принято на отдых для базовых измерений (обычно после 10-15 мин сидя покоя), во время или сразу после упражнений боя, и во всем после упражнений период (как правило, от 1-3 часов после прекращения упражнения).
  2. Использование универсальных мер предосторожности, первый стерилизовать пальца с 70% изопропилового спирта.
  3. Далее прокол сайт с помощью автоматизированной ланцет или аналогичного устройства. Хотя мы используем 30-калибр ланцет для обеспечения теме комфорта, большие иглы могут быть использованы.
  4. Сотрите первую каплю крови, а затем собирать крови в капиллярах или microvettes получавших литий гепарина для предотвращения свертывания крови.

2. Фенотипирование клеток и апоптоз Окрашивание

  1. Добавьте 10 мкл гепаринизированной цельной крови titred панели антител в 250 мкл буфера для связывания (см. таблицу 1 схема). Мы использовали фактор 1:20 разбавления успех, но каждая лаборатория должна титр их реагентов для определения наилучшего рабочего раствора.
    Таблица 1. Антитела панель для определения упражнения-индуцированного апоптоза лейкоцитов подмножеств. Ранний апоптоз была определена выражением Аннексин V, в то время как поздний апоптоз был определен двойной положительный маркировки с Аннексин V и 7-AAD. Некротические клетки Аннексин V-и 7-AAD + клеток только.
    Труба 1 Tube 2 Труба 3 Труба 4
    Клетки только трубки Аннексин V - FITC Аннексин V - FITC Аннексин V - FITC
    Антивирус правам CD4 - PE Антивирус правам CD8 - PE Антивирус правам CD19 - PE
    7-AAD 7-AAD 7-AAD
    Антивирус правам CD45RA - APC Антивирус правам CD45RA - APC

    7-AAD = 7-амино-актиномицин D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Помощник Т-лимфоцитов, CD8 = подавитель / цитотоксических Т-лимфоцитов, CD19 = В-лимфоцитов, CD45RA = подмножества наивные клетки, FITC = Fluorescein изотиоцианата, PE = фикоэритрин.
  2. Инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.
  3. Центрифуга на 1075 мкг в течение 5-10 минут.
  4. Декантировать, добавьте 300 мкл эритроцитов Лизис буфера и тщательно вихря.
  5. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.
  6. Добавить 300 мкл PBS, чтобы остановить лизиса реакции.
  7. Центрифуга на 1075 мкг в течение 5-10 минут.
  8. Декантировать, стойки, и добавить 50 мкл буфера для связывания.
  9. Анализ с помощью проточной цитометрии.

Рекомендуется, как минимум, следующие элементы управления быть использованы: клетки только трубки в качестве отрицательного контроля в выявлении фоне аутофлюоресценция и пробирки, содержащие каждый флуорохромом установить компенсацию во время начальной настройки потока цитометр. Кроме того, мы использовали бисер компенсации стандартных успешно, чтобы сопоставить наши эксперименты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Малоинвазивных Пример процедуры сбора и последующего анализа показано, для анализа как ранние и поздние фазы вызванная осуществлением лимфоцитов апоптоза. Кроме того, можно четко исключить те клетки, которые являются некротические, а не апоптоза. Эта процедура позволяет преодолеть недостатки и дискомфорт, связанный с инвазивной вены из локтевой области в нескольких точках времени до, во время и сразу после тренировки, или крепления катетера в течение всего срока осуществления боя. С точки зрения исследователей, такие пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Новый грант факультета с Советом факультета стипендию в Университете Западного Кентукки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Буфер для связывания при проточной цитометрииeBioscience00-4222-26
Буфер для лизиса эритроцитовeBioscience00-4333-57
Ланцетное устройствоAccu Check Soft TouchRoche Group
Капиллярные трубкиГепаринизированные капиллярные трубкиChase Scientific Glass, Inc.501
ЦентрифугаGmC LabGilson, Inc.PMS-880
Конъюгат Annexin V-FITCBiovision Inc.K201-400-1
Конъюгат CD4-PEАнтитела против антигенов человека, клон RPA-T4eBioscience12-0049-42
Конъюгат CD8-PEАнтитела против антигенов человека, клон OKT8eBioscience12-0086-73
Конъюгат CD19-PEАнтитела против антигенов человека, клон HIB19eBioscience12-0199-42
Раствор для окрашивания жизнеспособности 7-AADeBioscience00-6993-50
Конъюгат CD45RA-APCАнтитела против антигенов человека, клон HI100eBioscience17-0458-42
Проточный цитометрC6Accuri

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
  2. Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
  3. Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
  4. Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
  5. Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
  6. Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
  7. Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

V

Похожие статьи