Измененный Аннексин В / пропидия йодидом Апоптоз Пробирной для точной оценки клеточной смерти

Эта процедура может быть выполнена в 500 мкл силиконовая трубки или 6 мл полистирола с круглым дном FACS труб. Последний обычно используется при проведении анализа жизнеспособности в сочетании с другими процедурами. Все объемы указаны только для 6 мл полистирола с круглым дном FACS труб. Для 500 мкл силиконовая трубки, свести все объемы на 1 / 5.

Оптимальная концентрация для анализа потока цитометрии в 2-4 х 10 ^{6 клеток} на 200 мкл объема. Сотовые потери могут возникнуть в результате этой процедуры, и таким образом, мы рекомендуем, чтобы каждый образец состоит из 4 х 10 ^{6 клеток} в начале процедуры.

1. Сотовые подготовка

1. Урожай клеток - ссылаться на конкретные процедуры для соответствующих клеточных линий или первичного выделения клеток.
2. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
3. Ресуспендируют клеток в 2 мл 1 фосфат х солевым буфером (PBS) ^{- / -} (без кальция, магния нет).
4. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
5. Ресуспендируют клеток в 1 мл 1 х Аннексин V буфера для связывания.
6. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
7. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания.

2. Применение Аннексин V / PI пятно

1. Добавить Аннексин V в соответствии с рекомендациями производителя [например, 5 мкл Аннексин V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].
2. Инкубируйте труб в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре.
3. Добавить 100 мкл 1 х Аннексин V обязательным буфер для каждой реакции трубки. Там должно быть около 200 мкл в каждую пробирку.
4. Добавьте 4 мкл PI (Sigma, кат № Р-4864-10 мл), который был разбавленным 1:10 в 1 х Аннексин V связывающем буфере (т.е. 1 мкл PI с 9 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания). Это приведет к окончательной концентрации PI 2 мкг / мл в каждом образце.
5. Инкубируйте труб в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре.
6. Добавить 500 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания мыть клетки.
7. Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
8. Ресуспендируют клеток в 500 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания и 500 мкл 2% формальдегида для создания 1% формальдегида (фиксатором) решение. Смешайте трубы, осторожно стряхивая.
9. Fix образцы на льду в течение 10 минут. Кроме того, образцы могут храниться в течение ночи при 4 ° С в темноте. Если последний метод был выбран, удостоверьтесь, чтобы быть последовательным во всех трубах помечены Аннексин V / PI (в том числе компенсации управления).
10. Добавьте 1 мл 1 х PBS ^{- / -} для каждого образца и аккуратно перемешать, щелкая.
11. Пробирки центрифужные в 425 х г в течение восьми минут и сцедить супернатант.
12. Повторите шаги с 2.10 и 2.11.
13. Ресуспендируют гранул, щелкая трубки.
14. Добавить 16 мкл разбавленной 1:100 РНКазы (Sigma, R4642), чтобы дать конечной концентрации 50 мкг / мл. Инкубировать 15 минут при температуре 37 ° C.
15. Добавьте 1 мл 1 х PBS ^{- / -} и аккуратно перемешать, щелкая.
16. Пробирки центрифужные в 425 х г в течение восьми минут.
17. Образцы теперь готовы для анализа. Кроме того, образцы можно использовать для последующих шагов, если окрашивание Аннексин / PI окрашивание выполняется параллельно с другими процедурами.

3. Представитель Результаты:

Примеры типов клеток и клеточных линий, которые имеют различные степени ложно-положительных П. И. окрашивания показаны на рисунке 1. Для учета ложно-положительных событий, клетки фиксируют, а затем обрабатывают РНКазы А. Это приводит к значительному уменьшению количества ложно-положительных событий, по сравнению с клетками, которые не прошли РНКазы лечения (рис. 2В). Рис 2С показывает, представитель изображений клеток, подвергшихся РНКазы лечения, по сравнению с клетками, которые не имеют лечения РНКазы. Рисунок 3 показывает, как изменение Аннексин V / PI протокол, с фиксацией и шаги РНКазы лечения, улучшает обычные протоколы, ограничивая число ложно-положительных событий окрашивания.

Рисунок 1. Обычные протоколы йодида пропидий окрашивания привести к значительным числом ложных положительных событий. Ранее мы оценивали степень ложноположительных окрашиванию через первичные элементы в широком диапазоне моделей на животных, а также в различных клеточных линиях ^10. Представитель изображения показывают степень ложных срабатываний окрашивания в три уникальные клеточные популяции (обычно используются клеточные линии - RAW макрофагов и два первичных клеток - костного мозга мышиных макрофагов (БММ) и золотая рыбка первичной макрофагов почек (ПКМ)). Правда позитивных событий дисплей ожидается совместное локализации между ИП и DRAQ5 в ядерном отсеке (желтые области изображают колокализации между ИП и DRAQ5). DRAQ5 очень membraпе проницаемой краситель, который точно пятна ядерной отсеке и в живых и мертвых клеток ^10,11,12. Для облегчения визуального определения колокализации DRAQ5 пятна был дан зеленый pseudocolour.

Рисунок 2. Более точное значение PI окрашивание ядер. () Мы оценили точность П. И. окрашивание ядер в зависимости от степени сходства ряда хорошо известных ядерных пятна (BrdU, 7-AAD и DAPI), чтобы DRAQ5. BrdU представляет собой синтетический нуклеозид, которая включена в ДНК пролиферирующих клеток, и как таковая будет только пятно в ядерном отсеке. 7-AAD имеет высокое сродство к ДНК и, как и ИП, не может пересечь нетронутыми плазматической мембране. DAPI также имеет сильное сродство к ДНК и является наиболее часто используемых ядерных пятном в люминесцентной микроскопии. Степень сходства было> 99% в период с BrdU, 7-AAD, DAPI и DRAQ5, выделяя их способность точно пятно клеточного ядра в RAW 264,7 макрофагов. В отличие от цитоплазматического окрашивания П. И. на основе традиционных протоколов приводит к заметному снижению процента сходство окраски по отношению к DRAQ5. (Б) Подобные результаты наблюдаются в двух первичных элементов протестированы: мышиных макрофагов костного мозга (БММ) и золотая рыбка первичной макрофагов почек (ПКМ). Включение 50 мкг / мл РНКазы на определенном этапе в течение окрашивания процедура удаляет неядерных П. И. окрашивания и значительно увеличивает степень сходства по отношению к DRAQ5 окрашивания. (C) представитель образы первичных макрофагов почек показать степень сходства для клеток с и без лечения РНКазы. Для облегчения визуального определения различия между процедурами, DRAQ5 был дан зеленый. Желтый областях изображают колокализации между BrdU и DRAQ5, П. И. и DRAQ5.

Рисунок 3. Измененный Аннексин V / PI значительно снижает ложные апоптоз / некротические события. Первичная золотая рыбка почек макрофагов (ПКМ) были окрашены обычной и модифицированной Аннексин V / PI протоколов. Диаграммы рассеяния изобразить Аннексин V / PI пятна в золотой рыбки ПКМ. Рассеяния слева показывает обычные Аннексин V / PI окрашивания (без РНКазы) из ПКМ клеток. Рассеяния справа показывает ПКМ клеток, окрашенных изменение Аннексин V / PI протокол (с РНКазы). Помимо результатов РНКазы в выраженное снижение PI окрашивания из-за удаления ложных положительных пятен. ПКМ клетки были затем проанализированы на основе различных групп населения в рамках культур-предшественников ранней (EP), моноцитов (моно) и зрелых макрофагов (Мат Mac). Сокращение числа позитивных событий П.И., из-за удаления ложных положительных событий является более выраженным в крупных зрелых клеток макрофагов, чем в небольших ранних клеток-предшественников. Выводы, основанные на традиционных протоколов бы ошибочно предложил положительную корреляцию в клеточной смерти для более зрелых подмножества макрофагов.