Проточной цитометрии Очистка мыши мейоза клетки

Краткое содержание

Эффективный метод получения высокоочищенного жизнеспособной мейоза фракций из семенников мышей описана, который сочетает в себе изысканный клеточной диссоциации протокол с люминесцентными активированный сортировки клеток (FACS). Этот метод использует различия в содержании ДНК и ядерной плотности дискретных мейоза фракций.

Аннотация

Гетерогенный характер типов клеток в яичках и отсутствие мейоза модели культуры клеток были значительные препятствия для изучения уникальных программ дифференциации, которые проявляются во время мейоза. Два основных метода были разработаны для очистки, в разной степени, различных фракций мейоза от взрослых, так и незрелых животных: отмучивания или Staput (осаждение) с помощью BSA и / или Перколла градиентов. Оба эти методы основаны на размер ячейки и плотности отдельных мейоза клетки ^1-5. В целом, за исключением нескольких клеточных популяций ^6, эти протоколы не сможет привести к достаточной чистоты многочисленные мейоза клеточных популяций, которые необходимы для подробного молекулярного анализа. Кроме того, с такими методами как правило, один тип мейоза клетки могут быть очищены в данный момент времени, который добавляет дополнительный уровень сложности в отношении воспроизводимости и однородности при сравнении образцов мейоза клетки.

Здесь мы описываем точный метод, который позволяет легко визуализировать, идентифицировать, очистить и мейоза клетки, из половых клеток в круглых сперматид, используя FACS в сочетании с Hoechst 33342 окрашивание ^7,8. Этот метод обеспечивает общий снимок всего процесса мейоза и позволяет очистить высоко жизнеспособных клеток от большинства стадии мейоза. Эти очищенные клетки могут затем быть детально проанализированы для молекулярных изменений, которые сопровождают прогрессии через мейоз, например, изменения в экспрессии генов, ^9,10 и динамика нуклеосом размещение в горячих точках мейотических рекомбинации ^11.

Протокол

Этот протокол может быть разделен на два основных этапа: (1) диссоциация и Hoechst 33342 окрашивание мышиные клетки семенников затем, при необходимости, (2) FACS сортировки соответствующих фракций мейоза, включая все стадии мейоза, из половых клеток, чтобы круглые сперматиды. После сбора этих обогащенного мейоза населения может быть использован для широкого спектра анализа. Этот протокол описывает диссоциации одного яичка взрослого; объемы могут быть адаптированы соответственно для несовершеннолетних или для дополнительной яичек.

1. Яичко Диссоциация

1. Разместите один decapsulated яичка в 15-мл трубки.
2. Добавить 3-мл раствора соли Баланс Гей (в GBSS), содержащих 120 ЕД / мл коллагеназы типа I.
3. Добавьте 10 мкл ДНКазы I (1mg/ml маточного раствора в 50% глицерина) и энергично встряхните его вручную, пока не увидите яичек канальцах начинает диссоциировать.
4. Перемешивают горизонтально со скоростью до 120 оборотов в минуту в течение 15 мин при 33 ° C.
5. Декантировать в течение 1 мин вертикально при комнатной температуре и отбросить супернатант.
6. Повторите шаги с 1,2 до 1,5.
7. Добавить 2,5 мл GBSS содержащие коллагеназы типа I, 50 мкл 50мг/мл фондовом Трипсин решение ресуспендировали в 1 мМ HCl раствора и 10 мкл ДНКазы I (1mg/ml), и инвертировать трубку несколько раз.
8. Перемешивают горизонтально со скоростью до 120 оборотов в минуту в течение 15 мин при 33 ° C.
9. Использование пластиковой одноразовой пипетки Пастера с широким отверстием, пипетку осторожно вверх и вниз в течение 3 min.No скопления должны быть видны в этой точке.
10. Добавить 30 мкл трипсина, 10 мкл ДНКазы I, 40 мкл Hoechst 33342 ресуспендировали в ДМСО (10 мг / мл), и инвертировать трубку несколько раз.
11. Перемешивают горизонтально со скоростью до 120 оборотов в минуту в течение 15 мин при 33 ° C.
12. Добавить 400-мкл эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и перемешать путем обращения для инактивации трипсина.
13. Заключительное окрашивание производится путем добавления 50 мкл Hoechst 33342 ресуспендировали в ДМСО (10 мг / мл) и 10 мкл ДНКазы I (1 мг / мл).
14. Перемешивают горизонтально со скоростью до 120 оборотов в минуту в течение 15 мин при 33 ° C.
15. Диссоциированных образец яичка затем проходит через два 40-мкм GBSS предварительно смачивается одноразовые фильтры в течение 50-мл коническую трубку, затем 5 мкл йодида пропидий (PI) раствор добавляют и образец осторожно перемешивают с помощью пипетки несколько раз с одноразовыми Пастер пипетки.
16. Пример переносится на 5-мл пластиковый шприц через 18-иглы. Последняя заменяется 22-иглы для образца доставки. Шприца хранится на льду и защищенном от света до готовности для обработки СУИМ.

2. FACS настройки и очистки

1. Сортировка была выполнена на Becton Dickinson Ария-сортировщик ячейки ИМУ. Условиях, описанных поэтому его следует использовать в качестве отправной точки, особенно при использовании различного оборудования. Мы использовали условиях описанных выше ^7,8.
2. С Ария ИМУ не указал УФ лазер, мы адаптировали протокол для обнаружения Hoescht окрашивания использованием 405 нм лазер фиолетовый кроме того, мы использовали 488nm синий лазер для прямого и бокового рассеяния обнаружения. Кроме того, некоторые фильтры были изменены, с тем чтобы ограничить какие-то красные лазерные неплотности в результате чего улучшается рассеяны резкость сюжет.
3. Лазерной фиолетовый был настроен с 450/40nm полосы пропускания для обнаружения Hoescht Синий выбросов и 585/42nm полосы пропускания для выбросов Hoescht Red. 502nm длинный пас был использован для отдельных синий с красной флуоресценции.
4. 100 мкм сопла был использован с частотой падения привода 28000 капель / сек. Частота дискретизации порог составляет примерно 4000 событий / сек. Опция контроля температуры был использован для поддержания образца и сбор труб при 4 ° С всего времени сортировки. Кроме того, функция образец агитации была использована при 200 оборотов в минуту, чтобы предотвратить выборку из осаждающихся всей рода.
5. Обычно два-три яички были обработаны в 6 часов позволяет сортировать коллекцию 0,5-2.0x10 ^{6 ячеек} для каждой группы населения (см. раздел представителя).
6. Образец был отсортирован в аликвоты примерно 750μl освобождены от шприца. Между тем, во время этих пауз коллекции трубы хранились при температуре 4 ° С, защищенном от света, и осторожно перемешивают до возобновления рода.
7. Отсортированных образцы были собраны в 12x75mm стекла borosilicated трубки коллекцию, содержащую 250 мкл DMEM с добавлением 10% FCS.

3. Представитель Результаты:

Типичный профиль FACS показано на рисунке 1. Все основные шаги мейоза определены и указаны в легенде. Если Hoechst 33342 пятно не является оптимальным, глобальный профиль появится гораздо более компактным и менее определены. Общая проблема касается не добавляя достаточное ДНКазы, которая будет стимулировать быстрое слипание клеток. Добавление дополнительных ДНКазы на всех обвиняемых шаги обычно решает эту проблему. Стоп-йтрепетны из ДНКазы акций (хранить при температуре -20 ° С) должны быть сведены к минимуму, так как это приводит к быстрой потере активности фермента.

Spo11 является мейоза эндонуклеазы, которая направляет двунитевых разрывов в местах мейоза горячие точки рекомбинации ^12. Рисунке 2 показаны типичные профили Spo11-нуль яичка, где двухнитевых перерыв не образуются, в результате неудачного мейоза ^12, а также предварительно puberous профиля 13-дневного возраста мыши, которая показывает, асинхронный характер этой первой волны мейоза. Стандартный цитогенетический анализ с использованием сочетания синаптонемных белковый комплекс 3 (SCP3) и фосфорилированного гистона антител H2AX этап-специфических маркеров мейоза должны быть изначально предназначался для подтвердил чистоту и характер отсортированы мейотических клеток, как описано elswhere ^11.

Рисунок 1. Дикого типа мейоза FACS профилей. ) Участок представитель разброс показано на рисунке. Закрытого клетки показано на рисунке. Обратите внимание на большое количество мусора, присутствующих в яичках взрослого содержит в основном пустые оболочки и сперматиды хвосты. Б) представитель участок PI показывает очень ограниченное количество PI-положительных клеток, присутствующих в образце. Типичный ворота показано на рисунке. С), представитель дикого типа Hoechst 33342 FACS профиль показано на рисунке. Различных мейоза клеточных популяций, которые могут быть очищены с помощью этого метода для дальнейшего изучения указаны: сперматогонии (Sp), предварительно leptotene (PL), leptotene-зиготены (L / Z), раннего пахитены (EP), среднего пахитены ( МП), в конце-пахитены (LP), диплотенной (D), и круглые сперматиды (РС).

Рисунок 2. Spo11-нуль и дикого типа 13-й день мейоза профили FACS. А) типичный Spo11-нуль-профиля показан с ясным мейоза недостаточность, где нет этапе прошлого leptotene / зиготены раннего пахитены могут быть обнаружены. Б) профиль 13-дневных дикого самца мыши показывает высокую концентрацию leptotene / зиготены клеток. Это первая волна мейоза, а асинхронный, так же ясно, визуализированы с помощью этой методики.

Обсуждение

Протокол, представленные здесь, позволяет одновременно очистить от взрослых самцов мышей весь спектр мейоза клетки сцене с очень высокой чистоты, что позволяет исследователям для изучения динамики этого фундаментального процесса. Очищенные клетки могут быть использованы для многочисленных приложений, начиная от выделения РНК ^9,10, нуклеосом отображение ^11, рекомбинантный обнаружения молекулы белка анализы, и многое другое. Тем не менее, методы обнаружения должны быть адаптированы к сумме мейоза кле...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Коллагеназа 1-го типа	Worthington Biochemical	CLSS1	Растворить в GBSS до концентрации 12 000 Ед/мл, хранить при 4°C°C
Трипсин	Worthington Biochemical	TRL3	Растворить в 1 мМ HCl до концентрации 50 мг/мл, хранить при 4 °C°C
Н–chst 33342	Acros Organics	230001000	Насыщенный раствор (10 мг/мл в ДМСО, хранить при 4°C)°C
ДНКаза I	Sigma-Aldrich	DNEP	Растворить в воде/50% глицерине до концентрации 1 мг/мл, хранить при -20°C°C
Гей’Сбалансированный солевой раствор	Sigma-Aldrich	G9779
6" Переносная пипетка	Fisher Scientific	137119D