Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс</em

Краткое содержание

Здесь мы приводим протокол для проведения твердой пластиной, основанных на пищевых ограничений в С. Элеганс С убитых бактерий.

Аннотация

Сокращение потребления пищи без недоедания или голода как известно, увеличивает продолжительность жизни и замедления наступления различных возрастных заболеваний в широком диапазоне видов, в том числе млекопитающих. Это также приводит к снижению массы тела и плодородия, а также более низкие уровни глюкозы в плазме крови, инсулина и IGF-1 у этих животных. Это лечение часто упоминается как диетические ограничения (DR) или ограничение калорийности (CR). Элеганс нематоды Caenorhabditis стала важным организма модель для изучения биологии старения. Оба экологические и генетические манипуляции были использованы для модели DR и показали продлить продолжительность жизни C. Элеганс. Однако многие из сообщили DR исследования в С. Элеганс было сделано путем распространения животных в жидких средах, в то время как большая часть генетических исследований старения поле были сделаны на стандартных твердых агара в чашках Петри. Здесь мы приводим протокол DR с использованием стандартных твердых NGM агар основе пластины с убитых бактерий.

Протокол

1. Создание калибровочной кривой для оценки концентрации бактерий

В этом разделе описывается метод оценки концентрации бактерий для любого данного штамма бактерий (например, OP50, HT115), который будет использоваться в качестве источника пищи для экспериментов Диетические ограничения на языке C. Элеганс. Отдельные калибровочные кривые должны быть установлены для каждого штамма бактерий используется.

1. Привить единственная колония E. кишечной бактерии OP50 выбрать из свежих полоса бактерий на LB агар в 3 мл жидкого бульона LB.
2. Место OP50 культуры в 37 ° C шейкере и позволяют бактериям расти быстро.
3. Подготовка серийного 2-кратный разведения бактериальной суспензии из ночной культуры (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
4. Измерить абсорбцию (оптической плотности) каждого разведения при 600 нм на спектрофотометре в трех экземплярах.
5. Далее разбавленный каждой бактериальной суспензии 1000000 раз (1000-кратного разбавления дважды).
6. Распространение 0,4 мл бактериальной суспензии каждого разведения ровно на 100 мм пластины агара LB.
7. Место LB пластины с OP50 в 37 ° C инкубаторе в течение 18-24 часов.
8. Подсчитайте количество бактериальных колоний, выросших на каждой пластине. Колония насчитывает используются для расчета КОЕ (колониеобразующих единица) на мл для каждого образца.
9. Соотношение полученных OD ₆₀₀ ценности и OP50 бактерий концентрации могут быть созданы путем построения OD ₆₀₀ в зависимости от концентрации бактерий (КОЕ / мл) и выполняя анализ линейной регрессии (рис. 1).

Решения:

Отвар Лурия (LB), 1л:
10 г	Бакто-триптон
5 г	Дрожжевой экстракт
10 г	NaCl

Добавить деионизированной воды 1л.
Автоклавы и хранить при комнатной температуре.

2. Подготовка твердой пластиной, основанных на пищевых ограничений (SDR) пластин

В этом разделе описывается подготовка пластин для использования в твердой пластиной основанных на пищевых ограничений (СДР) экспериментов. Как правило, мы считаем, бактерий концентрации 1 х 10 ¹¹ КОЕ / мл, как вволю кормления состоянии и 1 х 10 ⁸ КОЕ / мл в качестве оптимального кормления DR условием для этого метода. Тем не менее, 4-6 различных концентраций бактерий могут быть необходимы для создания полной зависимости от дозы отношений для SDR и его ответы.

1. Привить единственная колония E. Coli OP50 бактерий в 3 мл бульона LB жидкости.
2. Место OP50 культуры в 37 ° C шейкере и позволяют бактериям расти в течение 6-8 часов.
3. Передача OP50 культуру новых колбу, содержащую 500 мл LB бульоне, и место OP50 культуры еще в 37 ° C шейкер в одночасье.
4. Измерить диаметр ₆₀₀ из OP50 культуры для определения бактерий концентрации (концентрации рассчитывается по калибровочной кривой, генерируемых в часть 1). Соответствующие разведения могут быть необходимы для точного измерения оптической плотности.
5. Гранул OP50 бактерий центрифугированием при 1500 г в течение 20 минут.
6. Ресуспендируют бактерий к концентрации 1 х 10 ¹² КОЕ / мл.
7. Подготовка 10 мл культуры бактерий в шести различных концентраций: 1 х 10 ^12, 10 ^{11, 10} 10, 10 ^9, 10 ^8, 10 ⁷ КОЕ / мл.
8. Пипетка 0,2 мл культуры бактерий в центре 60 мм затвердевших NGM пластины. Не прикасайтесь к поверхности пластины с пипетки, а ники на поверхности позволяют червей зарываются в агар пластин.
9. Место плит в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
10. Применяют 10 мкл из 100мг/мл карбенициллин и 10 мкл 50мг/мл канамицин для каждой пластины для ареста рост бактерий.
11. Магазин пластины с различными концентрациями антибиотиков убитых бактерий при температуре 4 ° C для дальнейшего использования (до одного месяца). Важно подготовить и хранить достаточно пластин для всего планируемого эксперимента, по крайней мере 1-2 дней вперед. Используя ту же партию пластин в течение всего эксперимента является предпочтительным.
12. Чтобы проверить жизнеспособность бактерий, очистить некоторые бактерии из SDR тарелки и разложил ее на пустую тарелку NGM с карбенициллин и канамицина. Место пластины в 37 ° C инкубаторе в течение 6-8 часов, а затем проверить для роста бактерий (нет роста бактерий должны быть соблюдены).

Решения

Нематоды Рост Медиа (НГО), 1л:
3 г	NaCl
2,5 г	Бакто-пептон
20г	Агар

ove_content "> Автоклав в течение 40 минут и дайте остыть до 65 ° С, затем добавить:

1 мл	1 М MgSO 4
1 мл	1 М CaCl 2
1 мл	5 мг / мл Холестерин
25 мл	1М фосфата калия, рН 6,0

Сразу же вылить жидкость NGM на 60 мм х 15 мм чашки Петри в 10 мл аликвоты

3. Настройка SDR экспериментов

На протяжении большей части SDR-соответствующих исследований, таких как жизнь анализ диапазона и плодородия профилирования, подготовка возрастных синхронизированы населения червей имеет важное значение. Для других исследованиях, просто перенести червей регулярные OP50 пластины пластины SDR инициировать диетических ограничений. В этом разделе, протокол о создании анализ продолжительности жизни для животных СПЗ описывается как пример.

1. Использование выбора платинового червь для передачи 20-30 репродуктивно активных взрослых на несколько регулярных пластин NGM с OP50. В зависимости от числа яиц, необходимых для экспериментов, более взрослые могут быть необходимы.
2. Оставьте пластин при 20 ° С в течение 4 часов, чтобы позволить откладки яиц.
3. Удалить взрослых от пластинки. Плиты должны быть визуально проверены на яйца.
4. Оставьте пластин при 20 ° С и позволяют потомства, чтобы развиться в Late-L4/day 1 взрослый этап. Обычно это занимает 3 дня для N2 диких червей типа при температуре 20 ° C.
5. Передача подходящее число 1-й день взрослым на пластине SDR инициировать диетических ограничений.
6. Для анализа продолжительности жизни, создать в общей сложности 6-8 пластин с 10-20 червей на пластине для каждого условия SDR.
7. Оценка жизнеспособности каждого червя каждые 2 дня, пока все черви умерли. Очень важно, что черви быть переданы на свежий пластин SDR каждые 12-48 часов, чтобы избежать полного лишения пищи.

4. Представитель Результаты:

Показанный на рисунке 1 представлена ​​зависимость кривой представитель калибровки для оценки OP50 концентрации по отношению к OD _600. Уравнение порожденных лайнер регрессионного анализа могут использоваться для всех будущих расчетов OP50 бактерий концентрации. Показанный на рисунке 2 является примером опробование эффект хронического лечения SDR на среднюю продолжительность жизни различных штаммов червя. Синяя линия представляет нормальную дозозависимый ответ дикого типа червей SDR. Красная линия показывает, что влияние продолжительности жизни SDR частично подавлены СРБ-2 э, в то время как DAF-16 (mu86) не оказывает влияния на SDR-индуцированной расширение жизни. Подробности метода для проведения анализа в продолжительности жизни C. Элеганс описана в предыдущей литературе ^1-3.

Рисунок 1. Представителю результате калибровочной кривой для оценки Е. Coli OP50 концентрации. OP50 концентрации строится в зависимости от измеряемой величины OD _600. Планки погрешностей = SD Ночь бактериальной культуры разбавляли 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x до измерения абсорбции, а затем разводят 1000 х дважды, прежде чем измерение КОЕ.

Рисунок 2. Представителю результате C. Элеганс жизни эксперимент сравнения дикого типа N2 животных (синий) с двумя различными мутантами (зеленый и красный) в ответ на SDR (Рисунок из Цзин и соавт. ^4). Планки погрешностей = SEM

Обсуждение

Диетические ограничения (DR), как известно, увеличивает продолжительность жизни и замедления наступления различных возрастных заболеваний в широком диапазоне видов, включая млекопитающих, ^5-7. Оба экологические и генетические манипуляции были использованы для модели DR на C. Элеганс, в том числе культивирование червей в полу-определены жидкой среде ^8,9, размывание бактериальных источников пищи в жидкую среду ^10-12, а также использование поведении мутантов, которые питаются более...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Карбенициллин	Duchefa Biochemie	C0109.25	Растворенного в воде.
Канамицин	Roche	10106801001	Растворенного в воде.
Бакто-пептонном	Becton, Dickinson и компании	DF0118072
Бакто-триптон	Becton, Dickinson и компании	DF0123075
Бакто-дрожжевой экстракт	Becton, Dickinson и компании	DF0127071
Агар	Becton, Dickinson и компании	DF00145170
Стерильная трубка культуры	США Научная	1485-0810
Спектрофотометр	Amersham Biosciences	Гена Квант про	Amersham сейчас является частью компании GE Healthcare.
Препаровальная лупа	Zeiss	Stemi 2000
Центрифуга	Beckman Coulter	Accuspin FR