Культура нормальных клеток в трехмерном контексте представляет альтернативный метод для изучения ранних событий, необходимых для сотовых трансформации и опухолей. Этот метод используется для выращивания нормального яичника и яйцевода клетках для изучения ранних событий в яичниках образование рака.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Альгинат гидрогелей для трехмерных органной культуры яичников и Яйцеводы
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Рак яичников занимает пятое место среди основных причин смерти от онкологических заболеваний у женщин и характеризуется уровнем смертности 63% в Соединенных Штатах1. Тип клеток, дающих начало раку яичников, всё еще остается предметом дискуссий; ими может быть как поверхностный эпителий яичника (OSE), так и дистальный эпителий фимбрий маточных труб2,3. Культивирование нормальных клеток в виде первичной культуры in vitro позволит ученым моделировать специфические изменения в различных типах эпителия, которые могут привести к развитию рака яичников, и тем самым окончательно определить тип клеток-предшественников. Это позволит разработать более точные биомаркеры, создать животные модели с тканеспецифичными генетическими изменениями и разработать более эффективные стратегии профилактики данного заболевания.
Содержание нормальных клеток в альгинатных гидрогелях способствует краткосрочному культивированию клеток in vitro в их трехмерном контексте и позволяет вводить плазмидную ДНК, siRNA и малые молекулы. Культивирование фрагментов органов, полученных путем стратегических разрезов скальпелем, позволяет создавать несколько культур из одного органа, что увеличивает количество экспериментов, проводимых на одном животном. Такие разрезы моделируют аспекты овуляции, которые приводят к пролиферации OSE, что связано с формированием рака яичников. Типы клеток, такие как OSE, которые плохо растут на пластиковых поверхностях, могут быть культивированы с помощью этого метода, что облегчает изучение нормальных клеточных процессов или самых ранних этапов онкогенеза4.
Альгинатные гидрогели могут использоваться для поддержки роста многих типов тканей5. Альгинат представляет собой линейный полисахарид, состоящий из повторяющихся единиц β-D-маннуроновой кислоты и α-L-гулуроновой кислоты, которые могут сшиваться ионами кальция, что приводит к мягкому гелеобразованию, не повреждающему ткани6,7. Как и другие трехмерные матрицы для культивирования клеток, такие как Matrigel, альгинат обеспечивает механическую поддержку тканей; однако белки не вступают в реакцию с альгинатной матрицей, поэтому альгинат функционирует как синтетический внеклеточный матрикс, который не инициирует клеточную сигнализацию5. Альгинатный гидрогель плавает в стандартной среде для культивирования клеток и поддерживает архитектуру роста ткани in vitro.
Представлен метод подготовки, разделения и иммобилизации фрагментов яичников и яйцеводов в альгинатных гидрогелях, которые могут поддерживаться в культуре до двух недель. Также описан метод ферментативного высвобождения клеток для анализа белков и образцов РНК из культуры органа. Наконец, возможен рост первичных типов клеток мышей без генетической иммортализации, что позволяет исследователям использовать нокаутные и трансгенные мыши.
Протокол
1. Рассечение тканей яичников и изоляции
- Подготовка 0,5% (вес / объем) раствор альгината натрия, готовят из модифицированную версию протокола описано выше 5, используя стерильные PBS и теплом до 37 ° C. Смешайте обращением или раскачивание, но не вихря. Нарисуйте альгината в 1 мл шприц с иглой 25 G и поддерживать при температуре 37 ° C.
- Подготовка 10 мМ CaCl 2 стерильный раствор для сшивания альгината на ткани инкапсуляции и теплой до 37 ° C.
- Подготовка 1 мл культуральной среды (αMEM + 5 единиц пенициллина и 5 мкг / мл стрептомицина) на лунку в 24-луночный планшет для каждого эксперимента. Включите различные препараты, пептиды, или вирусы в культуральной среде. Для трансфекции до органа инкапсуляции, инкубировать ткани с Lipofectamine 2000 и плазмидной ДНК в течение четырех часов при температуре 37 ° C.
- Рассеките органов у животных, удалить любой жир или остаточной ткани, аккуратно снять мембраны сумки окружающей яичники, и сократить яичников или яйцевод на четыре части по рассекает органа. Животные были подвергнуты эвтаназии СО 2 удушья следует шейки дислокации. Для яйцевода, осторожно разматывать ткань, потянув за исключением подключения мембран и расширение концах трубки в противоположных направлениях, с использованием щипцов перед сокращением.
- Место одной капли альгинат (~ 1-3 мкл) на стерилизованное сетки волокна.
- Использование стерильного пинцета, перенести часть орган в капле альгинат и в центре капли использованием щипцов или стерильной иглой.
- Обратить капли содержащие органа кусок (органоид), держа сетку волокна стерильным пинцетом и превращение его с ног на голову, чтобы заставить тяжести альгината в висячей капли.
- Нажмите пинцетом по краю блюда 10см Петри с 10 мМ CaCl 2 решения так, чтобы капля попадает в раствор.
- Инкубируйте в течение 2 минут, снимите с ложкой стерильный содержащих поры выпустить дополнительные 10 мМ CaCl 2, и передачи в культуральной среде. До четырех гелей альгината могут быть перенесены в одну лунку 24-луночный планшет содержащая питательной среды. Культура для определенного периода времени.
2. Деградация альгинат и сбора клеток
- Для солюбилизации альгинат гель, инкубировать культур в альгинат лиазы (3,4 мг / мл), растворенных в L-15 Лейбовиц медиа-при 37 ° С в течение 30 минут или пока гель полностью не растворится.
- Удаление ткани из альгината лиазы.
- Для сбора OSE, инкубировать органоид с 500 единиц коллагеназы в L-15 Лейбовиц средств массовой информации в течение 1 часа 8. Вихря в 2 секунды импульсов (2 секунды вихрь и 2 секундная пауза) на средней мощности в течение 1 минуты, а затем на 1 секунду импульсов (1 секунда вихря и 1 секунду отдыха) в течение 1 минуты. Давайте орган части приходятся на нижнюю часть трубки и пипетки микроцентрифужных супернатант в свежую стерильную пробирку микроцентрифужных. Центрифуга 3 минуты при 3000 оборотов в минуту до гранул поверхности эпителия яичников.
- Для сбора трубного эпителия, вырезать трубки в длину и место на культуре ткани пластика в DMEM с 5 единиц пенициллина и 5 мкг / мл стрептомицина и 4% (объем / объем) FBS. За 3-5 дней, клетки будут "ползти" из трубной стромы и растут на культуре ткани plastic9.
3. Фиксация альгинат инкапсулированные культуры орган для парафиновых срезов
- Сбор альгинат инкапсулированные бусину из культуральной среды на отдельных момент времени.
- Recrosslink альгинат ужесточить геля путем отказа от культуры в стерильные 10 мМ CaCl 2 решение в течение двух минут.
- Fix альгинат инкапсулированные орган в 2% параформальдегида, содержащий 50 мМ сахарозы, 10 мМ CaCl 2 и 50 ммоль натрия какодилатном чтобы гель остается твердой и полностью инкапсулирует ткани во время фиксации.
- После обработки ткани, вставлять весь альгинат-инкапсулированные органной культуры кусок в парафин и раздел с микротома генерировать 5 мкм разделов.
- Альгината будет распущен и удаляется из слайдов, если выполнение иммуногистохимического за счет тепла, основанные поиска антигена. Альгинат останется и пятна на эозином под стоящий гематоксилином и эозином окрашивания.
4. Представитель Результаты:
Примером трехмерного органа культуры яичников и маточных труб показано на рисунке 1. Яичники может быть разрезана на различные части размера и OSE размножаться и мигрировать на ремонт поверхности, которая была ранена из разрез скальпелем. Во время этого процесса, правильной ориентации OSE по отношению к основной стромы сохраняется, с OSE инкапсуляции яичника. Как показано на рисунке 2, OSE яичников разрезать пополам инкапсуляции яичников более полно по сравнению с яичниками разрезать на четверти или восьмыми. Рана ремонт яичниковповерхности могут быть изучены в контексте всего яичника и может пролить свет на процесс овуляции и ремонт поверхности вызывает превращение яичников поверхности.
Конечная точка эксперимента зависит от информации, которая требуется. Ткань архитектуры, клеточной морфологии и специфический клеточный рост легко контролировать с помощью парафиновых срезов. Например, один слой яичников поверхности эпителия наблюдается после культивирования в бессывороточной αMEM в течение 7 дней (рис. 3А), а добавлением 5 мкг / мл инсулина в течение 7 дней вызывает гиперпролиферацию эпителия яичников поверхности и формирование из нескольких слоев клетки (рис. 3В). Добавляя к бромдезоксиуридин культур в конечной концентрации 10 мкМ 24 часа до фиксации, пролиферацию клеток могут быть измерены (вставка 3A и 3B). Для культур поддерживается в бессывороточной αMEM, примерно 3-5% от OSE пройти распространения в течение 24 часов маркировки период (вставка 3А), в то время как больший процент клеток гранулезы размножаться. Добавление инсулина для питательных сред увеличивает процент пролиферирующих OSE приблизительно 30% от общего числа OSE (вставка 3B). Иммунофлуоресценции зеленого флуоресцентного белка (GFP) можно представить через гель альгината со стандартной микроскопии следующие кДНК трансфекции (рис. 3С). Хотя культура альгинат орган обеспечивает рост и анализа поверхности эпителия яичников и первичных фолликулов, следует отметить, что зрелые, вторичные фолликулы не могут выжить в этой системе культуры (рис. 3D). Культура отдельных фолликулов к погашению в течение матрица гидрогеля альгинат была описана в другом месте 10.
Изменения в белок или РНК могут быть проанализированы с весь орган или от определенных типов клеток с использованием ферментативного расщепления (рис. 4). Лечение культурный органоидов яичников с коллагеназы листьев основные стромы нетронутыми (рис. 4С), позволяя для обогащения OSE в осадок клеток, полученных после лечения, хотя некоторые из стромальных клеток, также изолированы (рис. 4D).
Рисунок 1. Мышь яичников трехмерные культуры система, используемая для распространения OSE после ранения. А) Под микроскопом, сумки и окружающей жировой ткани были удалены. Б) Неповрежденная яичников (O) с яйцевода трубки (Т) и жировая ткань (F). С) Завязь с бурсы и жировая ткань удаляется (слева) и развернутой яйцевода (справа). D) яичников или яйцеклада органоиды были помещены в альгинат капли. Е) альгинат заключенная органоиды были сброшены в CaCl 2 решения сшивания альгината с образованием геля. F) альгинат инкапсулированные яичников органоид. G) альгинат инкапсулированные яйцевода органоид. H) альгинат инкапсулированные органоидов инкубировали в культуральной среде.
Рисунок 2. Площадь возрожден яичников поверхности измеряется цитокератин 8. Инкапсуляция яичников органоидов по OSE после того, как разрезать на восьмые, четверти и половины, культивировали в среде BSA, и измеряется иммуногистохимического анализа с использованием цитокератин 8 (CK8) антител.
Рисунок 3. Альгинат культуры система позволяет прохождение факторов роста и трансфекции кДНК в операционной среде, но не поддерживает быстрый рост и созревание фолликулов. ) Яичников органоид культивировали в течение 7 дней в базальной среды проанализированы CK8 выражение, которое знаменует OSE. Врезка, серийный разделе витражи для включения BrdU. Б) дополнение инсулина для питательных сред вызывает гиперплазию OSE. Врезка, серийный разделе витражи для включения BrdU. С) яичников органоид трансфицированных кДНК выразить GFP. D) система альгинат культуры поддерживает рост первичных фолликулов (красная стрелка), но не зрелых вторичных фолликулов (черная стрелка).
Рисунок 4. OSE могут быть выделены для анализа следующие культуры. ) Органоид культивировали в среде до 2 недель. Б) Encapsulated органоид обрабатывают альгинат лиазы оставить органоид нетронутыми. Завязь окрашивали CK8 отметить OSE. С) органоид обрабатывают коллагеназы отделить от основного OSE стромы. Оставшийся кусок ткани окрашивали CK8 выделить удаление яичников поверхности. D) Сборник клеток после лечения обогащенные для OSE, как окрашивают в течение CK8 (красный). Клетки контрастно с DAPI, чтобы отметить ядер.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Развитие трехмерной органной культуры система, учитывающая альгинат гидрогелей представляет универсальный метод для анализа различных типов тканей от самых разнообразных организмов. Использование 3D-культур может быть распространено на области тканевой инженерии и регенеративной медицины, поскольку она обеспечивает эшафот, на котором клетки могут расти 11. В настоящее время наша лаборатория проходит начальные исследования с использованием человеческих яичников и маточных тканей трубки, однако культуре человеч...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Существует ничего разглашать.
Благодарности
Эта работа была поддержана исследования рака яичников фонд [грант LT/UIC/01.2011], МСЖД центр клинической и поступательного науки, МСЖД онкологический центр, Национальный институт здоровья грант C06RR15482.
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными AAALAC рамках утвержденных по уходу за животными протоколов уходу и использованию животных комитетом на МСЖД. Животные для этого проекта размещены в барьер номеров в биологических ресурсов лаборатории (BRL) в университете штата Иллинойс в Чикаго. BRL имеет полностью ветеринарного персонала, который контролирует животных по крайней мере два раза в день и дает рекомендации по уходу за животными.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (необязательно) |
| Лейбовиц L-15 средний | Гибко | 11415 | |
| αMEM среда | Гибко | 12000-022 | |
| Натрия альгинат | Novamatrix | ||
| Натрий какодилатном | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Полипропиленовые сетки волокна | McMaster Carr | 45 "широкий рулон; 0,0041" открытие | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Пенициллин / стрептомицин | Гибко | 15070-063 | |
| Альгинат лиазы | Sigma Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma Aldrich | C9697 | С Clostridium histolyticum |
| Бычий сывороточный альбумин | Депутат Biomedicals | 103700 | |
| Фетальной телячьей сыворотки | Гибко | Гибко | |
| Ее решение | Roche | 11074547001 | Инсулин / трансферрин / натрия селенит |
| Цитокератин 8 антител | Развивающие Исследования Гибридома банка | Трома-1 | Использование при 1:200 |
| DAPI | Векторные Labs | H1200 | |
| Бромдезоксиуридин | Сигма | B50002-1G | Конечная концентрация 10 мкМ |
Ссылки
- Jemal, A. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as biomaterials. Macromol Biosci. 6, 623-633 (2006).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C. Gonadotropins and ovarian cancer. Endocr Rev. 28, 440-461 (2007).
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
