Культура нормальных клеток в трехмерном контексте представляет альтернативный метод для изучения ранних событий, необходимых для сотовых трансформации и опухолей. Этот метод используется для выращивания нормального яичника и яйцевода клетках для изучения ранних событий в яичниках образование рака.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Альгинат гидрогелей для трехмерных органной культуры яичников и Яйцеводы
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Рак яичников занимает пятое место среди основных причин смерти от онкологических заболеваний у женщин и характеризуется уровнем смертности 63% в Соединенных Штатах1. Тип клеток, дающих начало раку яичников, всё еще остается предметом дискуссий; ими может быть как поверхностный эпителий яичника (OSE), так и дистальный эпителий фимбрий маточных труб2,3. Культивирование нормальных клеток в виде первичной культуры in vitro позволит ученым моделировать специфические изменения в различных типах эпителия, которые могут привести к развитию рака яичников, и тем самым окончательно определить тип клеток-предшественников. Это позволит разработать более точные биомаркеры, создать животные модели с тканеспецифичными генетическими изменениями и разработать более эффективные стратегии профилактики данного заболевания.
Содержание нормальных клеток в альгинатных гидрогелях способствует краткосрочному культивированию клеток in vitro в их трехмерном контексте и позволяет вводить плазмидную ДНК, siRNA и малые молекулы. Культивирование фрагментов органов, полученных путем стратегических разрезов скальпелем, позволяет создавать несколько культур из одного органа, что увеличивает количество экспериментов, проводимых на одном животном. Такие разрезы моделируют аспекты овуляции, которые приводят к пролиферации OSE, что связано с формированием рака яичников. Типы клеток, такие как OSE, которые плохо растут на пластиковых поверхностях, могут быть культивированы с помощью этого метода, что облегчает изучение нормальных клеточных процессов или самых ранних этапов онкогенеза4.
Альгинатные гидрогели могут использоваться для поддержки роста многих типов тканей5. Альгинат представляет собой линейный полисахарид, состоящий из повторяющихся единиц β-D-маннуроновой кислоты и α-L-гулуроновой кислоты, которые могут сшиваться ионами кальция, что приводит к мягкому гелеобразованию, не повреждающему ткани6,7. Как и другие трехмерные матрицы для культивирования клеток, такие как Matrigel, альгинат обеспечивает механическую поддержку тканей; однако белки не вступают в реакцию с альгинатной матрицей, поэтому альгинат функционирует как синтетический внеклеточный матрикс, который не инициирует клеточную сигнализацию5. Альгинатный гидрогель плавает в стандартной среде для культивирования клеток и поддерживает архитектуру роста ткани in vitro.
Представлен метод подготовки, разделения и иммобилизации фрагментов яичников и яйцеводов в альгинатных гидрогелях, которые могут поддерживаться в культуре до двух недель. Также описан метод ферментативного высвобождения клеток для анализа белков и образцов РНК из культуры органа. Наконец, возможен рост первичных типов клеток мышей без генетической иммортализации, что позволяет исследователям использовать нокаутные и трансгенные мыши.
Протокол
1. Рассечение тканей яичников и изоляции
- Подготовка 0,5% (вес / объем) раствор альгината натрия, готовят из модифицированную версию протокола описано выше 5, используя стерильные PBS и теплом до 37 ° C. Смешайте обращением или раскачивание, но не вихря. Нарисуйте альгината в 1 мл шприц с иглой 25 G и поддерживать при температуре 37 ° C.
- Подготовка 10 мМ CaCl 2 стерильный раствор для сшивания альгината на ткани инкапсуляции и теплой до 37 ° C.
- Подготовка 1 мл культуральной среды (αMEM + 5 единиц пенициллина и 5 мкг / мл стрептомицина) на лунку в 24-луночный планшет для каждого эксперимента. Включите различные препар....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Развитие трехмерной органной культуры система, учитывающая альгинат гидрогелей представляет универсальный метод для анализа различных типов тканей от самых разнообразных организмов. Использование 3D-культур может быть распространено на области тканевой инженерии и регенеративной медицины, поскольку она обеспечивает эшафот, на котором клетки могут расти 11. В настоящее время наша лаборатория проходит начальные исследования с использованием человеческих яичников и маточных тканей трубки, однако культуре человеч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Существует ничего разглашать.
Благодарности
Эта работа была поддержана исследования рака яичников фонд [грант LT/UIC/01.2011], МСЖД центр клинической и поступательного науки, МСЖД онкологический центр, Национальный институт здоровья грант C06RR15482.
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными AAALAC рамках утвержденных по уходу за животными протоколов уходу и использованию животных комитетом на МСЖД. Животные для этого проекта размещены в барьер номеров в биологических ресурсов лаборатории (BRL) в университете штата Иллинойс в Чикаго. BRL имеет полностью ветеринарного персонала, который контролирует животных по крайне....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (необязательно) |
| Лейбовиц L-15 средний | Гибко | 11415 | |
| αMEM среда | Гибко | 12000-022 | |
| Натрия альгинат | Novamatrix | ||
| Натрий какодилатном | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Полипропиленовые сетки волокна | McMaster Carr | 45 "широкий рулон; 0,0041" открытие | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Пенициллин / стрептомицин | Гибко | 15070-063 | |
| Альгинат лиазы | Sigma Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma Aldrich | C9697 | С Clostridium histolyticum |
| Бычий сывороточный альбумин | Депутат Biomedicals | 103700 | |
| Фетальной телячьей сыворотки | Гибко | Гибко | |
| Ее решение | Roche | 11074547001 | Инсулин / трансферрин / натрия селенит |
| Цитокератин 8 антител | Развивающие Исследования Гибридома банка | Трома-1 | Использование при 1:200 |
| DAPI | Векторные Labs | H1200 | |
| Бромдезоксиуридин | Сигма | B50002-1G | Конечная концентрация 10 мкМ |
Ссылки
- Jemal, A. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
