Эффективным методом для оценки поверхностной воздействия лептоспирозный белков описывается. Метод разработан специально, чтобы избежать разрушения хрупкой внешней мембраны лептоспирозный клеток. Этот метод требует применения нескольких отрицательных контролей для оценки целостности наружной мембраны и специфичность реакции антител.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иммуно-флуоресценции Проба лептоспирозный поверхности, подвергшихся воздействию белки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Поверхностные белки бактерий участвуют в прямом контакте с клетками хозяина и в поглощении питательных веществ из окружающей среды 1. По этой причине определение клеточной локализации может дать представление о функциональной роли бактериальных белков. Локализация бактериальных белков на поверхности является ключевым этапом на пути к идентификации факторов вирулентности, участвующих в механизмах патогенности.
Методы фракционирования мембран лептоспир 2-5 могут быть селективны в отношении определенного класса белков внешней мембраны (BВМ), например, липопротеинов по сравнению с трансмембранными BВМ, что может привести к их неправильной классификации. Вероятно, это обусловлено структурными различиями и особенностями их связи с внешней мембраной. Липопротеины связаны с мембранами посредством гидрофобного взаимодействия между N-терминальным липидным фрагментом (три жирные кислоты) и фосфолипидами липидного бислоя 6, 7. В отличие от них, трансмембранные BВМ обычно интегрированы в липидный бислой амфипатическими β-листами, организованными в структуру типа «бочки» 8, 9. Кроме того, наличие белка во внешней мембране не обязательно гарантирует, что этот белок или его домены экспонированы на поверхности. Известно, что внешние мембраны спирохет хрупки, поэтому требуются методы, предполагающие бережное обращение с клетками и использование контролей подповерхностных белков для оценки целостности внешней мембраны.
В данной работе мы представляем метод иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) для прямой оценки экспонирования белков на поверхности интактных лептоспир. Этот метод основан на распознавании поверхностных белков лептоспир антителами, специфичными к соответствующим антигенам. В данном случае антитела, специфичные к OmpL5410, выявляются после связывания с нативными, экспонированными на поверхности эпитопами. Сравнение реактивности антител к интактным и пермеабилизированным клеткам позволяет оценить клеточную локализацию и определить, присутствует ли белок селективно на поверхности лептоспир. Целостность внешней мембраны следует оценивать с помощью антител к одному или нескольким подповерхностным белкам, преимущественно локализованным в периплазме.
Метод поверхностного ИФА может быть использован для анализа экспонирования на поверхности любого белка лептоспир, к которому доступны специфические антитела. Как полезность, так и ограниченность данного метода зависят от способности используемых антител связываться с нативными эпитопами. Поскольку антитела часто вырабатываются против рекомбинантных белков, эпитопы нативных белков, экспонированных на поверхности, могут не распознаваться. Тем не менее, метод поверхностного ИФА является ценным инструментом для изучения компонентов неповрежденных бактериальных поверхностей. Этот метод может применяться не только для лептоспир, но и для других спирохет и грамотрицательных бактерий. Для получения более убедительных выводов об экспонировании OMP на поверхности рекомендуется использовать комплексный подход, включающий несколько методов локализации в клетке 10.
Протокол
1. Фиксация лептоспир в стеклах
- Лептоспир interrogans класс BSL2 возбудителя. Работа с живыми клетками требует надлежащего обращения, например, в перчатках, лабораторный халат и пипетки шаги в стерильных капотом.
- Расти лептоспир в EMJH medium11, с добавлением 1% сыворотки кролика при 30 ° С до достижения ими середине-конце логарифмической фазы (плотность 5 х 10 7 до 5 × 10 8 кл / мл) в течение примерно 6 дней.
- Урожай культуры центрифугированием при ~ 2000 мкг в течение 7 минут при комнатной температуре.
- Удалить супернатант аспирацией и осторожно ресуспендируют осадок в фосфатным буферным растворо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наша поверхности IFA метод похож на что используется для демонстрации поверхностного воздействия различных borrelial 15, 16 и лептоспирозный 12, 17 белков. Детали метода поверхностных IFA, описанные здесь, чтобы свести к минимуму манипуляции клеток в попытке сохранить целостность внешней мембраны, используя преимущества тенденция клеток лептоспир придерживаться стеклах. Метод включает в себя более низкой концентрации (2% против 4%) параформальдегида, стиральные с внешней мембраны стабилизирующим бу.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Это исследование было поддержано Общественной службы здравоохранения грант АИ-34 431 (на ПРЗ) из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, а также В. А. Медицинский научно-исследовательские фонды (на ПРЗ).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (необязательно) |
| Двух-и слайды камере стекла | Лаборатория-Tek | 177380 | |
| Кролик сыворотке | Рокленд Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Лептоспир обогащению EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 козьего анти-IgG кролика (H + L) | Invitrogen / Molecular Probes | -11034 | |
| Alexa Fluor 488 антимышиного IgG (H + L) | Invitrogen / Molecular Probes | -11029 | |
| 4'6-diamidino-2-фенил-индол дигидрохлорид (DAPI) | Invitrogen / Molecular Probes | D1306 | |
| Продлите Золотой анти-Fade монтажа среда | Invitrogen / Molecular Probes | P36930 | Равновесия до комнатной температуры перед использованием |
| Fisherfinest стекла Премиум Обложка | Рыболов | 12-544-14 | |
| Флуоресцентный микроскоп | Zeiss | Axioskop 40 |
Ссылки
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. In....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
