Методическая статья

Быстрое подход к высоким разрешением флуоресценции в Semi-ломтики толщиной мозга

16K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2807

⸱

26 июля 2011 г.

 ,  , 
1Department of Molecular & Human Genetics, Baylor College of Medicine (BCM), 2Precisionary Instruments Inc., 3Departments of Molecular & Human Genetics and Neuroscience, Baylor College of Medicine (BCM), 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем быстрый и простой способ изображения флуоресцентно меченых клеток в полу-ломтики толщиной мозга. Фиксируя, нарезка, и оптически очистки ткани мозга мы опишем, как стандартные epifluorescent или конфокальной микроскопии могут быть использованы для визуализации отдельных клеток и нейронных сетей в нетронутой нервной ткани.

Аннотация

Фундаментальной целью как базовой, так и клинической нейробиологии является более глубокое понимание идентичности, молекулярного состава и паттернов связности, характерных для нейронов как в здоровом, так и в пораженном мозге. В связи с этим значительные усилия были направлены на создание высокоразрешающих нейроанатомических карт1-3. Расширение молекулярной генетики и достижения в области световой микроскопии дали возможность исследовать не только морфологию нейронов, но и молекулярный и клеточный состав отдельных нейронов и связанных с ними сетей4. Значительный прогресс в методах маркировки и манипулирования нейронами с помощью трансгенных технологий и таргетного воздействия на гены у грызунов теперь позволяет исследователям по своему усмотрению «программировать» подмножества нейронов5-6. Вероятно, одним из наиболее значимых вкладов в современную нейробиологию стало открытие и клонирование генов, кодирующих флуоресцентные белки (FPs) у морских беспозвоночных7-8, а также их последующая модификация, что привело к созданию постоянно расширяющегося набора инструментов для витального репортинга9. Использование специфической для определенного типа клеток активности промотора для направленной экспрессии FP в отдельных популяциях нейронов теперь обеспечивает возможность проведения нейроанатомических исследований с генетической точностью.

Инженерия экспрессии FP в нейронах значительно расширила наше понимание структуры и функций мозга. Однако визуализация отдельных нейронов и связанных с ними сетей в глубоких тканях мозга или в трехмерном пространстве остается сложной задачей. Из-за высокого содержания липидов нервная ткань достаточно непрозрачна и проявляет автофлуоресценцию. Эти внутренние биофизические свойства затрудняют визуализацию и получение изображений флуоресцентно меченных нейронов с высоким разрешением с помощью стандартной эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии на глубине более нескольких десятков микрон. Чтобы преодолеть эту проблему, исследователи часто применяют методы серийной визуализации тонких срезов и последующей реконструкции10 или двухфотонную лазерную сканирующую микроскопию11. Основными недостатками этих подходов являются трудоемкая подготовка тканей в первом случае и чрезмерная стоимость оборудования во втором.

В данной работе мы представляем относительно быстрый и простой метод визуализации флуоресцентно меченных клеток в фиксированных полутолстых срезах головного мозга мыши с помощью оптического просветления и имиджинга. В прилагаемом протоколе мы описываем следующие методы: 1) фиксацию тканей мозга in situ путем интракардиальной перфузии, 2) препарирование и извлечение целого мозга, 3) стационарную заливку мозга в агарозу, 4) прецизионное приготовление полутолстых срезов с использованием современного вибратома, 5) просветление тканей мозга с помощью градиента глицерина и 6) монтирование на предметные стекла для световой микроскопии и z-стековой реконструкции (Рисунок 1).

Для подготовки срезов мозга мы использовали относительно новый прибор под названием «Compresstome» VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Данный прибор представляет собой полуавтоматический микротом, оснащенный системой с моторизованным продвижением и вибрирующим лезвием, функциональные особенности которого схожи с другими вибратомами. В отличие от других вибратомов, ткань, подлежащая срезанию, закрепляется в агарозном блоке внутри цилиндра из нержавеющей стали. Ткань выдавливается из цилиндра на заданную толщину и срезается движущимся вперед вибрирующим лезвием. Система «агарозный блок/цилиндр» обеспечивает воспроизводимость закрепления ткани, ее выравнивание и точность резания. По нашему опыту, «Compresstome» позволяет получать высококачественные срезы ткани для электрофизиологии, иммуногистохимии, а также для прямого монтажа и визуализации фиксированной ткани. В сочетании с методом оптического просветления мы демонстрируем здесь способ подготовки полутолстых фиксированных срезов мозга для флуоресцентной визуализации высокого разрешения.

Протокол

1. В местах фиксации мозга

* Подготовить шприц 10 мл (28 иглы), заполненной фосфатным буферным раствором (PBS).
* Подготовить шприц 10 мл (28 иглы), заполненной 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Резервный дополнительные 5-10 мл PFA / PBS для последующей фиксации.

  1. Inject экспериментальных внутрибрюшинно мыши с летальной дозой Avertin или Nembutal.
  2. Как только мышь седативные, влажные живота с этанолом и безопасной мыши на дно лотка слоистые с пробкой, воском, или силиконового эластомера использованием рассечение булавки. С животом вверх, безопасный четыре лапы на поверхность - распространяя их как можно шире.
  3. Захватите кожу щипцами на уровне грудины, и нарезать поперек, чтобы разоблачить печени. Вырезать сбоку, а затем вверх через ребра и диафрагму. Удалить лоскут ткани ребра и продолжают резки до сердца доступна.
  4. Пирс или надрез правое предсердие стечь циркулирующей крови.
  5. Флеш остаточной крови из кровеносной системы перфузии PBS через левый желудочек.
  6. Доступ же отверстие иглы, исправить все мыши последующими перфузии PBS / PFA через левый желудочек.

2. Препарирование мозга и добыча

  1. Снимите кожу с головы, шеи и черепа, сокращая вокруг канала уха и глаза орбиты, а затем, потянув за кожей кпереди подвергать черепа.
    * См. рисунок 2 для иллюстрации шагов 2,2) до 2,5)
  2. Использование кости ножницы, разрезать крест-накрест с высоты сокета носовых раковин костей. Сделайте это для каждой стороны. Поперечную должны быть впереди глаз и обонятельных луковиц.
  3. Разрезают вдоль друг от ушного канала, чтобы глаз.
  4. Использование маленькие ножницы рассечение, вырезать затылочной кости пластиной вышележащих мозжечка из одного наружного слухового прохода в другую.
  5. С той же ножницами рассечение, вырезать вперед по средней линии на уровне обонятельных луковиц.
  6. Использование пинцета, извлекайте каждый кости пластиной из головного мозга, заботясь, чтобы удалить все соединительные ткани так, что мозг остается неизменным при подъеме от костей.
  7. Snip оптические и черепно-мозговых нервов, вырезать верхнюю шейного позвонка, и удалить мозг в фиксатор.
  8. После исправления в течение 1-2 часов при температуре 4 ° С. Промыть 3 раза 15 мин каждый в PBS.

3. Агарозном вложение

  1. Растопите 2% высокопрочных, низкая точка-гель агарозы типа IB (Сигма номер по каталогу: A0576) в PBS солевых с микроволновой печью.
  2. Передача расплавленной агарозы в пробирке. Место пробирке в теплой ванне инкубатор или водой (40 ° -41 ° C) до температуры равновесия.
  3. Клей фиксированные ткани мозга на поршень шприца с образцом цианакрилатного клея (рис. 3А). Кисть тонкий слой насыщенного сахароза-би-эс раствора на поверхность ткани мозга для облегчения последующего высвобождения кольцо агарозы из мозга ломтиками.
  4. Перенос поршень с мозговой ткани в корпус плунжера (рис. 3В).
  5. Внесите или залить теплой агарозы в корпус плунжер, покрывая ткани головного мозга. Избежать захвата пузырьков воздуха в агарозы. Пузырьки воздуха в агарозном пойдет на компромисс срез качества.
  6. Зажим образца шприц с холодной (от 0 ° до -25 ° C) охлаждения блока в течение 1 минуты, чтобы установить агарозы (рис. 3С).

4. Секционирование мозга срез с Compresstome

  1. Соберите образец шприц, содержащий мозговой ткани в Compresstome (рис. 3D).
  2. Совместите край лезвия бритвы в тесном контакте с выходом образца шприц (рис. 3Е).
  3. Заполнение буферная емкость с раствором PBS.
  4. Поворот микрометра один ломтик толщиной вперед для выдавливания агарозном-мозговую ткань блок из образца шприц.
  5. Нажмите кнопку "Пуск" на блок управления Compresstome инициировать секционирования процесса.
  6. Повторите шаги 4,4) до 4,5) до желаемой ломтики получаются на определение толщины.
  7. Урожай мозга ломтики с кистью или пипеткой флаконах или окрашивания скважин, заполненных с PBS (рис. 3F).

5. Оптический Клиринговый

  1. Подготовка 75% по объему: том решением глицерина: PBS.
  2. Налейте (или пипетки) от половины объема PBS вымыть из собранных ломтики мозга.
  3. Плюс объем удален с глицерином / PBS.
  4. Разрешить, чтобы уравновесить с нежным смешивания при температуре 4 ° С до раковины ломтиками.
  5. Повторите шаги 6,2) до 6,4) до конечной концентрации глицерина достигает 75%.
  6. Замените решение с 90% глицерина в ФБР и позволить, чтобы уравновесить.
    * Примечание: Будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков воздуха при добавлении глицерина решений. Налейте решения медленно и аккуратно перемешать, так как пузырьки воздуха будет вмешиваться в единый equilibraТион и будут перенесены на слайд монтажа.

6. Фрагмент монтажа для работы с изображениями

  1. Вырезать двусторонняя печать клея (SA-S-1L, Грейс Био-Labs) в открытый прямоугольник по размеру видимой области микро слайд (SuperFrost Кроме того, 25 X 75 X 1 мм, кат. # 48311-703, VWR ) со сторонами 2-3 мм шириной.
  2. Место мозга ломтики в центре клейкой лентой прямоугольник с помощью пипетки или кистью. Удалите излишки глицерина с нежным аспирации.
  3. Устройте ломтики мозга на слайде в желаемом порядке с кистью.
  4. Осторожно опустите покровного стекла (24 X 60 мм, кат. # 48383-139, VWR) на клейкой лентой, следя за тем, чтобы не вводить пузырьков воздуха. Осторожно надавливайте на покровное стекло, чтобы обеспечить контакт с помощью клейкой ленты.
  5. Аспирируйте избыток глицерина из ребра между горкой и покровного стекла.
  6. Печать слайдов и покровное с использованием четких лак для ногтей.
  7. Дайте высохнуть, прежде чем изображение или сохранить долгосрочный слайд ящиках при температуре 4 ° C.

7. Представитель Результаты:

Обработки, визуализации и анализа флуоресцентно меченных мозговой ткани стали незаменимыми для изучения нейробиологии. Многие из этих исследований требуют сложных генетических манипуляций получить репортер выражение в целевых нейронов подмножества, а затем как с низким и высоким разрешением, анализ изображений. Часто экспериментальные и технические ограничения не позволяют получить эти типы данных из того же животного, или в быстрой манере. Подготовка оптически очищается, полу-толстый мозга разделы для флуоресцентной визуализации помогает в этом проблема. Примером нетронутыми толстый ломтик мозга помечены генетически модифицированного вируса бешенства спроектирован, чтобы выразить EGFP и отображаемого использованием epifluorescent и конфокальной микроскопии показано на рисунках 4 и 5 соответственно. Для epifluorescent визуализации мы использовали Leica M205 Англии, так и для конфокальной захвата изображений мы использовали Zeiss LSM 510. Из-за относительной простоты прилагается протокол, этот метод может дать полезные данные изображения из ткани выражения флуоресцентные журналистам с оборотное время менее чем за один день, и совместим как с низким и высоким разрешением световой микроскопии.

Если следователь примет решение включить дополнительные посмертных маркировки методами, иммуногистохимического окрашивания, или сделать тоньше разделы, протокол удлиняется соответственно. Однако описанный выше метод представляет собой простой и относительно высокой пропускной методом проверки моделей жизненное проявление репортером в интактном мозге.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема diagraming фиксации, рассечение, нарезки, очистки, и монтажные процедуры полу-ломтики толщиной мозга.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема последовательной резки шаги, чтобы извлечь неповрежденный мозг мыши.

Рисунок 3
Рисунок 3. Шаги для установки и нарезать мозговой ткани использованием Compresstome. ) Размещение мозговой ткани на режущих поршень использованием суперклеем. B) Рисунок вниз установлен мозговой ткани в поршень для встраивания агарозы. С) Укрепляя плагин агарозном головного мозга с использованием охлажденной блок компрессии. D) Включение агарозном подключить мозг и поршень в камере резки Compresstome. E) Выравнивание лезвие бритвы, чтобы устройство поршень. F), резки и сбор мозга ломтики в камеру буфера Compresstome.

Рисунок 4
Рисунок 4. Свет изображений микроскопии толстый ломтик с глицерином-очищенный мозговой ткани через лобную кору выражения расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP). А) корональные срез мозга мыши (200 мкм) помечены вирусный вектор выражения EGFP и отображаемого в низком разрешении использования epifluorescent стереоскоп. Шкала бар, 2 мм.

Рисунок 5
Рисунок 5. Высокая увеличения изображения флуоресцентно меченных слой 5 / 6 корковые нейроны в очищается толстый ломтик мозга. А) Высокое разрешение конфокальной образ максимальной проекции Z-Stack (150 мкм) по региону выделено (рис. 4). Шкала бар, 25 мкм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Учитывая широкое применение использования флуоресцентных белков для целевой нейронов подмножества для исследования с помощью световой микроскопии, заинтересованных в быстром экран, изображение и анализ нейронных сетей в неповрежденной ткани мозга стала бесценным.

Технический прогресс в развитии удобной вирусных векторов, в естественных методов электропорация, и генетически модифицированных линий мышей в настоящее время обеспечивает казалось бы, неограниченный источник меченых типов ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Цзянь-Цян Конг сотрудник Precisionary Instruments, Inc, которая производит продукт, используемый в этой статье.

Благодарности

Эта работа финансировалась поддержку через Фонд Макнейр, NARSAD и NINDS грант R00NS064171-03.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название пункта О компании Номер в каталоге Комментарии (опционально)
Кости ножницы FST 16044-10 Или эквивалент
Ножницы рассечение FST 14084-08 Или эквивалент
Типа IB агарозном Sigma A0576
Compresstome Precisionary инструменты VF-200-Vibratomes других совместимых
Двухсторонней клейкой Грейс Био-Labs SA-S-1L
SuperFrost Плюс слайдов VWR 48311-703
Крышка стекла VWR 48383-139
Глицерин EMD химических ООО GX0185-6 Или эквивалент

Ссылки

  1. Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. The Connectome Project. , (2009).
  2. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  3. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  4. Arenkiel, B. R., Ehlers, Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
  5. Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244, 1288-1292 (1989).
  6. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
  7. Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
  8. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Gene fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  9. Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  10. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  11. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи