Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

12.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2813

⸱

16 июля 2011 г.

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

В этой статье

Краткое содержание

Исключая виво Протокол для получения зрелых человеческих красных кровяных клеток из стволовых / прародителей описано. Кроме того, мы описываем эффективные лентивирусов-Метод доставки нокдаун TAL1 транскрипционных факторов в первичных эритроидных клеток. Эффективность лентивирус опосредованной доставки гена GFP продемонстрировать с помощью выражения вирусов.

Аннотация

Эритропоэз является широко используемой модельной системой для изучения дифференцировки клеток. В ходе эритропоэза плюрипотентные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) взрослого человека дифференцируются в олигопотентные предшественники, коммитированные клетки-предшественники и зрелые эритроциты 1. Этот процесс в значительной степени регулируется на уровне экспрессии генов, при которой специфические факторы транскрипции активируют гены, характерные для данной клеточной линии, одновременно подавляя гены, специфичные для других типов клеток 2. Исследования факторов транскрипции, регулирующих эритропоэз, часто проводятся с использованием клеточных линий человека и мыши, которые в определенной степени представляют эритроидные клетки на различных стадиях дифференцировки 3-5. Однако трансформированные клеточные линии могут лишь частично имитировать эритроидные клетки и, что наиболее важно, они не позволяют всесторонне изучить динамические изменения, происходящие по мере прохождения клеток через множество стадий на пути к их окончательной эритроидной судьбе. Таким образом, актуальной задачей остается разработка протокола получения относительно гомогенных популяций первичных ГСК и эритроидных клеток на различных стадиях дифференцировки в количествах, достаточных для проведения геномных и протеомных экспериментов.

В данной работе мы описываем протокол культивирования клеток ex vivo для индуцирования эритроидного дифференцирования гемопоэтических стволовых клеток/клеток-предшественников человека, выделенных из пуповинной крови, костного мозга или мобилизованной G-CSF периферической крови взрослых (лейкаферез). Эта система культивирования, изначально разработанная в лаборатории Дуая 6, использует цитокины и совместное культивирование с мезенхимальными клетками для имитации микроокружения костного мозга. Используя данный протокол дифференцирования ex vivo, мы наблюдаем значительную амплификацию эритроидных предшественников, индукцию дифференцирования исключительно в эритроидном направлении и полное созревание до стадии безъядерных эритроцитов. Таким образом, эта система предоставляет возможность изучить молекулярные механизмы транскрипционной регуляции по мере продвижения гемопоэтических стволовых клеток по эритройдному пути.

Изучение эритропоэза на транскрипционном уровне также требует возможности гиперэкспрессии или нокдауна специфических факторов в первичных эритроидных клетках. Для этой цели мы используем систему доставки генов с помощью лентивируса, которая позволяет эффективно инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки 7. Здесь мы демонстрируем возможность эффективного нокдауна транскрипционного фактора TAL1 в первичных эритроидных клетках человека. Кроме того, экспрессия GFP показывает, что эффективность лентивирусной инфекции близка к 90%. Таким образом, наш протокол предоставляет весьма полезную систему для характеристики регуляторной сети транскрипционных факторов, контролирующих эритропоэз.

Протокол

Часть I. Эритропоэз гемопоэтических стволовых клеток/клеток-предшественников человека ex vivo

1. Выделение человеческих гемопоэтических стволовых клеток/клеток-предшественников CD34+

Популяция клеток CD34+ человека, содержащая смесь гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и ранних предшественников 8, собирается из пуповинной крови, периферической крови, мобилизованной с помощью G-CSF (лейкаферез), или костного мозга (Рисунок 1-Шаг1). При использовании пуповинной или периферической крови переходите непосредственно к шагу 1.2. При использовании костного мозга начните с шага 1.1. Перечень реагентов и оборудования приведен в Таблице 1.

Этот этап выполняется в стерильных условиях (например, в вытяжном шкафу) и при RT, если не указано иное.

  1. Приготовление суспензии единичных клеток костного мозга:
    1. Ресуспендируйте костный мозг в 10 объемах среды RPMI 1640, содержащей 0,02% коллагеназы B и 100 Ед/мл ДНКазы 1
    2. Осторожно перемешивайте на шейкере-весах в течение 45 мин.
    3. Профильтруйте клетки через нейлоновый фильтр с размером пор 30 мкм.
  2. Выделите мононуклеарные клетки (МНК) низкой плотности методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll:
    1. Разбавьте суспензию крови или костного мозга 2–4 объемами PBS, содержащего 2% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 2 мМ ЭДТА. Примечание: использование большего объема увеличивает чистоту мононуклеарных клеток (МНК).
    2. В коническую пробирку объемом 50 мл осторожно наслаивают 35 мл разведенной суспензии клеток поверх 15 мл Ficoll-paque. Центрифугируют при 400g в течение 30 мин с использованием ротора с навесными стаканами без торможения.
    3. Аспирируйте верхний слой, не затрагивая промежуточный слой мононуклеарных клеток (МНК).
    4. Перенесите интерфазный слой (содержащий МНК) в новый конический центрифужный флакон объемом 50 мл.
    5. Добавьте PBS, содержащий 2% FBS и 2 мМ EDTA, чтобы заполнить пробирку, аккуратно перемешайте путем инверсии и центрифугируйте при 300g в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант.
    6. Промойте осадок клеток еще 2 раза, чтобы удалить тромбоциты. Прим.: данный этап позволяет повысить чистоту CD34+ клетки
    7. Возьмите 20 мкл клеточной суспензии и перенесите в пробирку Эппендорф. Добавьте 200 мкл буфера для лизиса эритроцитов (Таблица 1) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 мин. Поместите 18 мкл этой суспензии в камеру Гематоцитометра и подсчитайте количество нуклеированных мононуклеарных клеток (МНК).
    8. МНК можно использовать сразу или заморозить при -10°C8 клеток/мл в культурной среде, содержащей 10% ДМСО, и хранящихся в жидком азоте.
  3. Выделение CD34+ клетки методом положительной иммуномагнитной селекции (Рисунок 1, Шаг 1)
    Мы используем набор CD34 Microbead Kit (содержащий раствор микросфер, конъюгированных с моноклональными мышиными антителами к человеческому CD34, и раствор блокирующего реагента FcR, содержащий IgG человека) в сочетании с двумя колонками LS Mini-Macs, буфером для работы autoMACS и сепаратором MiniMACS (Таблица 1). Ниже мы описываем наш протокол, начиная с 2,3x108 МНК. При использовании другого количества клеток объемы следует соответствующим образом увеличить или уменьшить. Кроме того, для количества до 2x108 Для выделения мононуклеарных клеток (МНК) вместо колонки LS MiniMacs можно использовать колонку MS MiniMacs.
    Держите клетки и реагенты в охлажденном состоянии (4–8°C), чтобы предотвратить агрегацию антител на поверхности клеток и неспецифическое мечение клеток.
    1. Ресуспендируйте осадок, содержащий 2,3x108 МНК в 690 мкл бегущего буфера (300 мкл на 10⁸ МНК, где 300 мкл является минимальным требуемым объемом суспензии) и перенесите в коническую пробирку объемом 15 мл.
    2. Добавьте 230 мкл блокирующего реагента FcR
    3. Добавьте 230 мкл раствора микросфер CD34 MicroBeads.
    4. Тщательно перемешайте вручную и инкубируйте в течение 30 мин при 4°C.
    5. Промойте клетки, добавив 10 мл бегающего буфера, и центрифугируйте при 300g в течение 10 мин.
    6. Полностью аспирируйте супернатант.
    7. Ресуспендируйте клетки в 1,2 мл бегающего буфера (используйте 0,5 мл буфера на 108 МНК (мононуклеарные клетки)) Примечание. Перед проведением магнитной сепарации важно получить суспензию одиночных клеток. При необходимости пропустите клетки через нейлоновый фильтр с размером пор 30 мкм для удаления клеточных агрегатов.
    8. Подготовьте колонку LS, поместив ее в магнитное поле сепаратора MiniMACS.
    9. Промойте колонку 3 мл рабочего буфера.
    10. Нанесите 1,2 мл клеточной суспензии на колонку.
    11. Соберите проскок и используйте его для проверки выхода и чистоты CD34+ изоляция клеток. В качестве альтернативного варианта заморозьте клетки, содержащиеся в данной фракции, и храните их в жидком азоте. Примечание: эта фракция содержит немеченые клетки, а также может содержать некоторое количество меченых CD34+ клеток.+ клетки, которые не прикрепились к колонке.
    12. Промойте колонку трижды 3 мл рабочего буфера, объедините промывочные фракции и используйте полученный объем аналогично фракции сквозного потока, описанной выше.
    13. Снимите колонку с магнита и поместите ее в полипропиленовую пробирку для сбора объемом 15 мл.
    14. Для элюции клеток добавьте 5 мл рабочего буфера (Running Buffer) в колонку и немедленно промойте ее для вымывания меченых клеток CD34.+ закрепите клетки, с силой нажав на поршень в колонку.
    15. Повторите процедуру колоночной очистки (шаги h–n), пропуская клетки через свежеподготовленную колонку LS. Прим.: это повышает чистоту CD34+ клеток. Из суспензии с концентрацией 2,3x108 При выделении МНК методом лейкафереза мы обычно получаем 1,1x106 CD34+ клетки с чистотой > 95±3% (Рисунок 1 — Шаг 1).
    16. Заморозьте клетки в культуральной среде, содержащей 10% DMSO, и храните их в жидком азоте или перейдите непосредственно к шагу 2).

2. Эритроидная дифференцировка в клеточной культуре

Клетки CD34+ культивируют в дополненной среде IMDM с последовательным добавлением гидрокортизона и специфических комбинаций цитокинов согласно четырехэтапному протоколу, адаптированному из 6 (Рисунок 1-Этап 2). На протяжении всей процедуры проводится серия тестов для проверки роста клеток и эритроидной дифференцировки.

Количество клеток CD34+, необходимых для начала культивирования, варьируется в зависимости от масштаба эксперимента. Как правило, для исследований экспрессии генов мы проводим маломасштабное культивирование, начиная с 0,1x106 клеток CD34+ в 10 ml среды, поддерживая малые объемы путем замораживания избыточных клеток на протяжении всей процедуры. Для исследований, требующих экстракции белков, культивирование проводится в большем масштабе. Здесь мы описываем крупномасштабный эксперимент, в котором мы начинаем с ~7x106 клеток CD34+, выделенных из лейкафереза.
На всех этапах соблюдаются стерильные условия. Реагенты указаны в таблицах 1, 2 и 3.

  1. Подготовка реагентов
    1. Приготовьте дополненную среду IMDM, как описано в Таблице 2, и заморозьте аликвоты по 40 мл при -20°C (можно сделать заранее).
    2. Приготовьте стоковые растворы гидрокортизона и цитокинов, как описано в Таблице 3.
  2. Этап 1: День 0-11
    Гемопоэтические клетки выращивают в дополненной среде IMDM, содержащей гидрокортизон (HC), фактор стволовых клеток (SCF), интерлейкин 3 (IL-3) и эритропоэтин (EPO) (Таблица 3). Стромальные клетки костного мозга мыши MS-5 (Таблица 1) нарабатывают в preparation к Этапу 2.
    • День 0:
      1. Предварительно нагрейте 120 мл дополненной среды IMDM и добавьте HC, SCF, IL-3 и EPO (Таблица 3).
      2. Разморозьте 7x106 клеток CD34+, сначала поместив флакон(ы) в водяную баню при 37°C. Пока клетки еще заморожены, добавьте 1 мл предварительно нагретой среды и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте флакон 2 мл среды и перенесите содержимое в пробирку объемом 15 мл.
      3. Добавьте 6 мл среды к клеточной суспензии, перемешайте путем переворачивания пробирки и центрифугируйте при 200 g в течение 5 мин.
      4. Аспирируйте супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 10 мл свежей среды.
      5. Посчитайте живые клетки с помощью гемоцитометра после смешивания 10 μl клеточной суспензии с 10 μl раствора трипанового синего (Таблица 1). Примечание: гибель клеток при размораживании составляет около 25%, поэтому концентрация живых клеток должна быть ~0,5x106 клеток/мл.
      6. Отберите примерно 3 мл клеточной суспензии для тестов (см. пункт 6).
      7. Перенесите оставшиеся 7 мл в колбу T-175 и добавьте 63 мл среды, чтобы получить концентрацию 0,05x106 клеток/мл в 70 мл, и поместите колбу в инкубатор при 37°C.
    • День 1:
      1. Предварительно нагрейте 85 мл среды для культивирования клеток MS-5: αMEM с Glutamax (Таблица 1), 10% FBS и 100 U/ml пенициллина и 100 μg/ml стрептомицина.
      2. Подготовьте три круглые чашки для культивирования размером 150 мм x 25 мм, в каждую из которых высейте 2x106 клеток MS-5 в 25 мл среды для получения концентрации 0,08x106 клеток/мл и поместите в инкубатор при 37°C. Примечание: наилучшие результаты достигаются при использовании клеток MS-5 с низким числом пассажей (<20). Конфлюэнтную культуру следует расширять путем разделения (сплиттинга) 1:5 каждые три дня с использованием трипсина, содержащего 0,05% EDTA.
    • День 2:
      1. Посчитайте гемопоэтические клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~20 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: по нашему опыту, в течение первых 2 дней гибель клеток может превышать 30-50%, и таким образом конечная концентрация клеток обычно близка к той, что была в День 0 (Рисунок 2).
      2. Замените культуральную среду MS-5 на 25 мл свежей среды, убедившись, что неприкрепившиеся клетки MS-5 удалены.
    • День 4:
      1. Посчитайте гемопоэтические клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~10 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: к этому моменту клетки должны начать пролиферировать, при этом более >75% клеток должны быть живыми при концентрации ~0,2x106 клеток/мл. Клетки можно заморозить при концентрации 1-2x106 клеток/мл в дополненной среде IMDM, содержащей 10% DMSO, и хранить в жидком азоте.
      2. Перенесите оставшиеся ~40 мл культуры в колбу T-175 и добавьте достаточное количество дополненной среды IMDM, содержащей HC, SCF, IL-3 и EPO (Таблица 3), чтобы достичь конечного объема 150 мл. Примечание: концентрация клеток должна быть ~0,05x106 клеток/мл.
      3. Расширьте культуру клеток MS-5 (которые должны быть конфлюэнтны на 60-70%), разбавив их 1:5 в новые круглые чашки для культивирования 150 мм x 25 мм с использованием трипсина 0,05% EDTA. Конечная концентрация клеток должна быть ~0,08x106 клеток/мл. Примечание: обычно одну чашку можно расширить 5 раз, так что у вас должно получиться 15 чашек с клетками MS-5 при концентрации ~0,08x106 клеток/мл.
    • День 6:
      1. Посчитайте гемопоэтические клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~5 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: клетки находятся в стадии активной пролиферации, и концентрация клеток должна поддерживаться на уровне ≤1,5x106 клеток/мл. Если концентрация клеток выше, добавьте свежую дополненную среду IMDM, содержащую HC, SCF, IL-3 и EPO.
    • День 7:
      1. Посчитайте гемопоэтические клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки. Примечание: по нашему опыту, к 7-му дню клетки обычно достигают плотности 1,5x106 клеток/мл.
      2. Добавьте достаточное количество среды для поддержания концентрации клеток ~0,8x106 клеток/мл. Примечание: обычно мы добавляем 100 мл свежей дополненной среды IMDM, содержащей HC, SCF, IL-3 и EPO, чтобы получить 245 мл клеток при ~0,8x106 клеток/мл.
      3. Расширьте культуру клеток MS-5 (которые должны быть конфлюэнтны на 60-70%), разбавив их 1:5 в колбы T-175 (вместо чашек) с использованием трипсина 0,05% EDTA. Конечная концентрация клеток должна быть ~0,08x106 клеток/мл. Примечание: следует подготовить 61 колбу с клетками MS-5 при ~0,08x106 клеток/мл. Заморозьте оставшиеся клетки MS-5 и храните их в жидком азоте.
    • День 8:
      1. Посчитайте гемопоэтические клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~5 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: плотность клеток должна быть ~1x106 клеток/мл.
      2. Предварительно нагрейте 2 л дополненной среды IMDM, содержащей только SCF и EPO (Таблицы 2 и 3).
      3. Соберите 200 мл гемопоэтической культуры (содержащей ~200x106 клеток), центрифугируйте при 200 g в течение 10 мин., аспирируйте супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 40 мл дополненной среды IMDM, содержащей SCF и EPO.
      4. Распределите клеточную суспензию по 8 колбам T-175 (по 5 мл на колбу) и добавьте в каждую колбу 245 мл дополненной среды IMDM, содержащей SCF и EPO. Примечание: теперь у нас есть 8 колб, каждая из которых содержит 250 мл клеток при 0,1x106 клеток/мл.
      5. Оставшиеся клетки (~40 мл) на 8-й день можно заморозить при 1-2x106 клеток/мл в дополненной среде IMDM, содержащей 10% DMSO, и хранить в жидком азоте.
    • День 10:
      1. Посчитайте гемопоэтические клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~5 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: плотность клеток должна быть ~1x106 клеток/мл.
  3. Этап 2: День 11-15
    Примерно половина клеток собирается для дальнейшего использования (например, для экстракции ядер). Остальные эритроидные клетки культивируют совместно с клетками MS-5 в дополненной среде IMDM, содержащей EPO (Таблицы 2 и 3). Эритроидные клетки должны переноситься на свежий слой MS-5 каждые 3-4 дня.
    • День 11:
      1. Посчитайте эритроидные клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки. Примечание: плотность клеток должна быть ~1,5x106 клеток/мл.
      2. Предварительно нагрейте при 37°C 1 л 1xPBS, 400 мл дополненной среды IMDM и 5 л дополненной среды IMDM, содержащей EPO (Таблицы 2 и 3).
      3. Отберите объем культуры, эквивалентный 15x108 клетокм (например, ~4 колбы по 250 мл каждая), и перейдите к пункту e.
      4. Оставшиеся клетки (например, 15x108) собирают в конические пробирки, центрифугируют при 450 g в течение 10 мин., ресуспендируют в холодном буфере MS30 (Таблица 5), содержащем 0,1 мМ DTT, с максимальной концентрацией 108 клеток/мл и хранят при -80°C после мгновенного замораживания в жидком азоте для дальнейшего использования (например, для ядерного экстракта).
      5. Промойте 50 колб с конфлюэнтными клетками MS-5, используя по 20 мл 1xPBS для каждой, и немедленно добавьте в каждую колбу 80 мл свежей дополненной среды IMDM, содержащей EPO. Примечание: из-за большого количества колб мы обрабатываем по 4 колбы за раз. Точнее, мы достаем из инкубатора 4 колбы с конфлюэнтными клетками MS-5, промываем их 1xPBS, добавляем 80 мл среды и возвращаем колбы в инкубатор. Когда все колбы подготовлены и возвращены в инкубатор, мы переходим к шагу f. Из-за количества колб, которые необходимо обработать при крупномасштабной процедуре, целесообразно выполнять эти действия двумя людьми одновременно.
      6. Центрифугируйте количество эритроидных клеток, эквивалентное 15x108, в 4 конических пробирках при 450 g в течение 10 мин. и удалите супернатант.
      7. Промойте 4 клеточных осадка, используя по 100 мл дополненной среды IMDM для каждого.
      8. Ресуспендируйте каждый клеточный осадок в 250 мл дополненной среды IMDM, содержащей EPO, и распределите по 20 мл этой клеточной суспензии в каждую из 50 колб, содержащих клетки MS-5 и 80 мл среды. Примечание: на этом этапе у вас должно быть 50 колб с конфлюэнтными клетками MS-5, содержащих 100 мл эритроидных клеток при 0,3x106 клеток/мл.
      9. Расширьте оставшиеся 11 колб с клетками MS-5, разбавив их 1:5 в колбы T-175 с использованием трипсина 0,05% EDTA. Конечная концентрация клеток должна быть ~0,08x106 клеток/мл. Примечание: следует подготовить 55 колб с клетками MS-5 при ~0,08x106 клеток/мл.
    • День 12:
      1. Посчитайте эритроидные клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~4 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: плотность клеток должна быть ~0,6x106 клеток/мл.
    • День 14:
      1. Посчитайте эритроидные клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~3 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: плотность клеток должна быть ~0,9x106 клеток/мл.
  4. Этап 3: День 15-18
    Часть клеток собирается для дальнейшего использования (например, для экстракции ядер). Остальные эритроидные клетки культивируют совместно с клетками MS-5 в дополненной среде IMDM без цитокинов.
    • День 15:
      1. Посчитайте эритроидные клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки. Примечание: плотность клеток должна быть ~1x106 клеток/мл.
      2. Предварительно нагрейте при 37°C 1 л 1xPBS и 5 л дополненной среды IMDM (Таблица 2).
      3. Отберите объем культуры, эквивалентный 10x108 клеткам (например, ~10 колб по 100 мл каждая), и перейдите к пункту e.
      4. Оставшиеся клетки (например, 40x108) собирают и ресуспендируют в холодном буфере MS30 (Таблица 5), содержащем 0,1 мМ DTT, для дальнейшего использования (см. Этап 2: День 11, пункт d).
      5. Промойте 50 колб с конфлюэнтными клетками MS-5, используя по 20 мл 1xPBS для каждой, и немедленно добавьте в каждую колбу 80 мл свежей дополненной среды IMDM.
      6. Центрифугируйте количество эритроидных клеток, эквивалентное 10x108, в 4 конических пробирках при 450 g в течение 10 мин. и удалите супернатант.
      7. Промойте 4 клеточных осадка, используя по 100 мл дополненной среды IMDM для каждого.
      8. Ресуспендируйте каждый клеточный осадок в 250 мл дополненной среды IMDM и распределите по 20 мл этой клеточной суспензии в каждую из 50 колб, содержащих клетки MS-5 и 80 мл среды. Примечание: на этом этапе у вас должно быть 50 колб с конфлюэнтными клетками MS-5, содержащих 100 мл эритроидных клеток при 0,2x106 клеток/мл.
      9. Расширьте оставшиеся 5 колб с клетками MS-5, разбавив их 1:5 в колбы T-175 с использованием трипсина 0,05% EDTA. Конечная концентрация клеток должна быть ~0,08x106 клеток/мл. Примечание: следует подготовить 20 колб с клетками MS-5 при ~0,08x106 клеток/мл. Заморозьте оставшиеся клетки MS-5 и храните в жидком азоте.
    • День 16:
      1. Посчитайте эритроидные клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~4 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: плотность клеток должна быть ~0,6x106 клеток/мл.
  5. Этап 4: День 18-26
    Эритроидные клетки концентрируют в 3-4 раза, чтобы получить конечную концентрацию 5-7x106 клеток/мл, и поддерживают на слое MS-5 для обеспечения созревания. В дополненную среду IMDM добавляют 10% FBS для лучшей сохранности культивируемых эритроцитов (cRBCs).
    • День 18:
      1. Посчитайте эритроидные клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~2 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: плотность клеток должна быть ~1,7x106 клеток/мл.
      2. Предварительно нагрейте при 37°C 300 мл 1xPBS и 1,5 л дополненной среды IMDM (Таблица 2), содержащей 10% FBS.
      3. Промойте 15 колб с конфлюэнтными клетками MS-5, используя по 20 мл 1xPBS для каждой, и немедленно добавьте в каждую колбу 80 мл свежей дополненной среды IMDM.
      4. Центрифугируйте эритроидные клетки (т. е. количество, эквивалентное 85x108 клеток) при 450 g в течение 10 мин., объедините и распределите осадок по 4 коническим пробиркам.
      5. Ресуспендируйте каждый клеточный осадок в 75 мл дополненной среды IMDM, содержащей 10% FBS, и распределите по 20 мл этой клеточной суспензии в каждую из 15 колб, содержащих клетки MS-5 и 80 мл среды. Примечание: на этом этапе у вас должно быть 15 колб с конфлюэнтными клетками MS-5, содержащих 100 мл эритроидных клеток при 6x106 клеток/мл.
      6. Расширьте оставшиеся 5 колб с клетками MS-5, разбавив их 1:5 в колбы T-175 с использованием трипсина 0,05% EDTA. Конечная концентрация клеток должна быть ~0,08x106 клеток/мл. Примечание: следует подготовить 20 колб с клетками MS-5 при ~0,08x106 клеток/мл. Заморозьте оставшиеся клетки MS-5 и храните в жидком азоте.
    • День 20:
      1. Посчитайте эритроидные клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~1,5 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: плотность клеток поддерживается на уровне ~1,5x106 клеток/мл.
    • День 22:
      1. Посчитайте эритроидные клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~1,5 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: плотность клеток поддерживается на уровне ~1,5x106 клеток/мл.
      2. Смените среду и перенесите эритроидные клетки на новые слои клеток MS-5, как описано для 18-го дня.
    • День 24:
      1. Посчитайте эритроидные клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~1,5 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: плотность клеток поддерживается на уровне ~1,5x106 клеток/мл.
    • День 26:
      1. Посчитайте эритроидные клетки с помощью трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки, и соберите необходимое количество клеток (т. е. ~1,5 мл культуры) для тестов (см. пункт 6). Примечание: плотность клеток поддерживается на уровне ~1,5x106 клеток/мл.
      2. Соберите неприкрепившиеся безъядерные и полностью гемоглобинизированные cRBCs. Примечание: зрелые cRBCs можно хранить в среде SAGM (MacoPharma) при 4°C до одного месяца.
  6. Тесты и репрезентативные результаты
    Следующие тесты проводятся в указанные дни для проверки правильности пролиферации клеток и эритроидной дифференцировки. Репрезентативные результаты, представленные на рисунках, были получены с использованием клеток CD34+, выделенных методом лейкафереза.
    1. Подсчет клеток проводится каждые два дня. Репрезентативный результат пролиферации клеток показан на Рисунке 2.
    2. Окрашивание морфологии по методу Май-Грюнвальда-Гимзы проводится каждые два дня с использованием 0,05x106 клеток для дней с 0 по 8 и 0,2x106 клеток для остальных дней согласно инструкциям производителя красителя Гимзы (Таблица 1). Репрезентативные результаты показаны на Рисунке 3.
    3. Полужидкие анализы проводятся в дубликатах для измерения количества гемопоэтических предшественников каждые два дня с 0-го по 12-й день, используя 0,01x106 клеток на один анализ согласно инструкциям производителя полужидкой среды Methocult (Таблица 1). Репрезентативные результаты показаны на Рисунке 4.
    4. Анализ следующих клеточных маркеров проводится каждые два дня методом FACS: CD34, CD36, CD71, GPA, LDS с использованием 0,2x106 клеток на один анализ. Репрезентативные результаты показаны на Рисунке 5.
    5. Содержание гемоглобина измеряется каждые два дня путем окрашивания бензидином. Репрезентативные результаты показаны на Рисунке 5.
    6. Экспрессия генов изучается с помощью RT-qPCR или микрочипов после экстракции РНК из 1x106 клеток. Репрезентативные результаты показаны на Рисунке 6B.

Комментарии к результатам:

На рисунке 1 представлена схема протокола дифференцировки клеток CD34+ человека ex vivo в зрелые, содержащие гемоглобин эритроциты. В процессе эритроидной дифференцировки клетки характеризуются высокой пролиферативной активностью, что иллюстрирует примерно 8 000-кратное увеличение числа клеток, показанное на рисунке 2, которое было получено с использованием CD34+ клеток, выделенных методом лейкафереза. Клетки CD34+, выделенные из костного мозга, обладают чуть меньшей пролиферативной способностью с увеличением примерно в 6 000 раз, в то время как клетки CD34+, выделенные из пуповинной крови, могут достигать 50 000-кратного увеличения. Клетки на определенных стадиях дифференцировки имеют характерные размеры и морфологию, которые представлены на рисунке 3. Обратите внимание на процесс энуклеации, который начинается на 20-й день и происходит в конце дифференцировки. К 26-му дню все клетки теряют ядра (рисунок 3).

Анализы колониеобразующей способности, представленные на рисунке 4, используются для выявления ранних и поздних гемопоэтических предшественников в первые дни дифференцировки (с 0-го по 8-й день). Помимо эритроидных предшественников (CFU-E и BFU-E), мы отмечаем, что гранулоцитарно-макрофагальные предшественники (CFU-GM) значительно представлены среди ранних CD34+ клеток на 0-й день. По мере прохождения дифференцировки количество CFU-GM существенно снижается, и к 6-му дню они полностью замещаются эритроидными предшественниками BFU-E и CFU-E. Также важно отметить, что с 4-го по 6-й день ранние эритроидные предшественники BFU-E постепенно замещаются более дифференцированными клетками CFU-E. К 10-му дню эритроидные клетки практически полностью утрачивают способность к образованию колоний.

Наконец, за эритропоэзом следят по экспрессии клеточных поверхностных маркеров, как показано на рисунке 5. Обратите внимание на: 1) прогрессирующую потерю маркера гемопоэтических стволовых клеток/прогениторов CD34; 2) постепенное появление и последующую потерю маркера прогениторов CD36; 3) постепенное появление и последующую потерю маркера эритроидных прогениторов и ретикулоцитов CD71; и 4) увеличение экспрессии маркера эритроидных предшественников и эритроцитов GPA. Другими маркерами эритроидной дифференцировки являются синтез гемоглобина, начинающийся на 8-й день (определяется путем окрашивания бензидином — Рисунок 5), и энуклеация клеток, начинающаяся на 20-й день, что определяется по исчезновению окрашивания ДНК красителем LDS (Рисунок 5). Наконец, эритроидную дифференцировку можно оценить с помощью RT-qPCR молекулярных маркеров, таких как фактор транскрипции TAL1 (Рисунок 6B) или гены β-глобина (данные не представлены).

Обычно 1 ml пуповинной крови / лейкафереза / костного мозга содержит 0,35x105 / 0,5x105 / 1,1x105 CD34+ клеток, которые теоретически могут дать 1,7x109 / 0,4x109 / 0,7x109 эритроцитов при соответствующих показателях пролиферации 50 000 / 8 000 / 6 000. Для получения 50x106 эритроцитов по завершении процедуры дифференцировки потребуется примерно 50 ml питательной среды.

Часть II. Лентивирусный нокдаун в процессе дифференцировки эритроидных клеток ex vivo

Лентивирус является предпочтительным инструментом для переноса генов в первичные клетки человека (см., например, Amsellem et al. 9). Лентивирусы часто используются для нокдауна целевых генов в первичных клетках путем доставки специфических shRNA (см., например, Laurenti et al. 10). В данном протоколе мишенью является транскрипционный фактор TAL1 в первичных эритроидных клетках человека. В качестве отрицательного контроля используется shRNA со скремблированной последовательностью, которая не соответствует ни одному из известных генов. Экспрессия GFP используется для оценки эффективности трансдукции.

1. Приготовление частиц лентивирусного вектора

Для получения лентивирусных частиц клетки эмбриональной почки человека 293T котрансфицируют тремя плазмидами: одной, включающей систему упаковки вируса второго поколения, кодирующую гены HIV-1, за исключением env, vpr, vif, vpu и nef (т. е. psPAX2); одной, кодирующей оболочку вируса с псевдотипом G белка вируса везикулярного стоматита (т. е. pMD2G); и одним лентивирусным вектором, кодирующим интересующий ген (т. е. pBLOCK-it6-DEST(shTal1), кодирующий shRNA TAL1, pBLOCK-it6-DEST(shScr), кодирующий скрамблированную shRNA, или pWPIP, кодирующий GFP) (Таблица 4). Лентивирусные частицы собирают из супернатанта клеточной культуры трансфицированных клеток 293T.

Чтобы избежать нежелательного заражения клеток, все эксперименты с лентивирусами (подготовка вирусов и инфицирование) проводятся в отдельном ламинарном шкафу, изолированном от других клеточных культур. Кроме того, отходы, содержащие лентивирус, утилизируются отдельно. Лентивирусы второго поколения, описанные в данном протоколе, являются репликативно-дефектными, и с ними следует работать как с организмами 2-го уровня биологической безопасности (BSL-2). В некоторых учреждениях могут действовать особые правила техники безопасности при работе с лентивирусами, поэтому мы рекомендуем придерживаться установленных внутренних инструкций вашего учреждения.

Ниже описан протокол, позволяющий получить достаточное количество лентивирусных частиц для инфицирования от 1 до 2 миллионов первичных эритроидных клеток на любой стадии дифференцировки. Объемы следует соответствующим образом корректировать при масштабировании процесса в большую или меньшую сторону. Перечень реагентов приведен в таблицах 4 и 5.

  1. Трансфекция клеток 293T фосфатом кальция.
    1. За один день до трансфекции высейте 13.2 x 106 клеток 293T в 20 мл среды DMEM/High glucose, содержащей 10% FBS и Pen/Strep, в чашку для культивирования клеток диаметром 15 см. Примечание: это позволит клеткам достичь 70% конфлюэнтности к дню трансфекции. Лучшие результаты достигаются при использовании клеток 293T с низким числом пассажей (<20).
      Дополнительно: чашки можно покрыть коллагеном I типа или поли-L-лизином для усиления адгезии клеток 293T.
    2. За два часа до трансфекции аспирируйте среду из клеток 293T и осторожно добавьте 20 мл свежей среды, предварительно нагретой до 37°C. Примечание: обычно мы начинаем трансфекцию в конце дня.
    3. Смешайте следующие реагенты в пробирке объемом 5 мл:
      • 44.8 μg экспрессионного вектора для интересующего вас гена (например, shRNA или GFP — см. таблицу 4)
      • 13.35 μg оболочечного вектора pMD2.G.
      • 33.48 μg упаковочного вектора psPAX2.
      • Добавьте достаточное количество стерильной H2O, чтобы довести объем до 1.116 мл.
    4. Добавьте достаточное количество стерильной H2O, чтобы довести объем до 1.116 мл.
    5. Добавьте 109.8 μl CaCl2 2.5M и перемешайте на вортексе.
    6. В коническую пробирку объемом 50 мл добавьте 1.116 мл буфера 2xHBS (таблица 5).
    7. При постоянном перемешивании на вортексе по каплям добавьте смесь ДНК в буфер 2xHBS.
    8. Дайте преципитату образоваться при комнатной температуре в течение 20 мин. (не более 30 мин.).
    9. По каплям добавьте раствор объемом 2.3 мл в чашку с клетками 293T, осторожно перемешайте круговыми движениями и перенесите клетки в инкубатор при 37°C на 12-14 часов.
    10. Ранним утром следующего дня аспирируйте среду и замените ее 20 мл свежей среды, предварительно нагретой до 37°C.
  2. Сбор и концентрирование лентивируса
    1. Через сорок восемь часов после трансфекции соберите 20 мл среды, содержащей лентивирус, и перенесите в коническую пробирку объемом 50 мл.
    2. Добавьте 20 мл среды, предварительно нагретой до 37°C, к клеткам 293T и верните их в инкубатор.
    3. Центрифугируйте вирусную супернатант при 450 g в течение 10 мин., чтобы удалить клеточный дебрис, и перенесите в новую пробирку объемом 50 мл. Альтернативно супернатант можно пропустить через фильтр 0.45μm. Храните очищенный супернатант при 4°C.
    4. Через двадцать четыре часа соберите оставшиеся 20 мл среды. Примечание: по нашим данным, титры вируса примерно эквивалентны в обоих сборах, т. е. 1x 106 TU/ml.
    5. Для концентрирования вирусов вирусные супернатанты распределяют по пробиркам Beckman OptiSeal (используйте 32.4 мл супернатанта на пробирку) и центрифугируют при 100,000g в течение 1.5 ч при 4°C с использованием поворотного ротора. Примечание: альтернативные методы концентрирования супернатанта вируса включают центрифугирование при 47,000 g в течение 2 ч или при 3,000 g в течение 8 ч. Не замораживайте вирус перед концентрированием. Замораживание приведет к преципитации белков, что затруднит ресуспендирование вируса.
    6. Сразу после ультрацентрифугирования медленно аспирируйте супернатант с помощью пластиковой пипетки на 10 мл и удалите его. Примечание: будьте осторожны, чтобы не потревожить осадок, который может легко отделиться от стенки пробирки. После удаления первых 5 мл супернатанта мы обычно срезаем верхнюю часть пробирки для ультрацентрифуги, чтобы максимально удалить супернатант, т. е. оставляем ~100-200 μl среды на дне пробирки.
    7. Добавьте 100 μl 1xPBS, дайте осадку раствориться при комнатной температуре в течение 30 мин. и ресуспендируйте, повторяя всасывание и вытеснение пипеткой 15-20 раз. Примечание: обычно мы получаем ~200-300 μl концентрированного вируса.
    8. Концентрированный препарат лентивируса титруют на клетках NIH3T3 по протоколу Invitrogen (система экспрессии лентивирусной РНК-интерференции Block-it). Примечание: обычно мы получаем вирусные титры от 2 до 10x108 трансдуцирующих единиц (TU)/ml.
    9. Теперь вирус можно использовать для инфицирования (см. параграф 2) или разделить на аликвоты и хранить при -80°C до 6 месяцев. Примечание: не подвергайте вирусные суспензии более чем одному циклу замораживания-оттаивания. Вирусы стабильны в течение 4-5 ч при 37°C, 2-3 дней при комнатной температуре или одной недели при 4°C.

2. Лентивирусное заражение первичных эритроидных клеток для доставки гена

  1. Инфицирование
    Ядреные эритроидные клетки могут быть эффективно инфицированы на любой стадии дифференцировки при условии использования высокой множественности заражения (MOI) в диапазоне 50-100. Здесь мы описываем типичный эксперимент, в котором для инфицирования эритроидных клеток на 8-й и 9-й дни дифференцировки используются лентивирусы, экспрессирующие TAL1 или scramble shRNA, с MOI 50 TU/cell. Для проверки уровня нокдауна TAL1 методом RT-qPCR экстракция РНК проводится каждые 24 часа. Параллельно с помощью FACS измеряется экспрессия GFP для оценки эффективности инфицирования (репрезентативные результаты представлены на Рисунке 6).
    • День 0:
      1. Подготовьте три конических пробирки по 15 мл, содержащие по 1x106 эритроидных клеток в каждой (т. е. одну пробирку для нокдауна TAL1, одну для отрицательного контроля со scramble-последовательностью и одну для контроля экспрессии GFP).
      2. Промойте клетки 5 мл дополненной среды IMDM, содержащей SCF и EPO (см. Часть I), центрифугируйте при 200 g в течение 5 мин. и удалите максимально возможный объем супернатанта.
      3. Добавьте полибрен (Таблица 4) до конечной концентрации 40 μg/ml в концентрированный раствор вируса.
      4. Добавьте 100 μl концентрированного вируса (т. е. 5x107 TU), содержащего полибрен, в каждую пробирку с эритроидными клетками.
      5. Инкубируйте в течение 1 ч в инкубаторе при 37°C, перемешивая путем легкого постукивания пальцем по пробирке каждые 10 мин. Примечание: инфицирование следует проводить в минимальном объеме среды для обеспечения максимальной адсорбции лентивируса на клетки. Кроме того, перемешивание каждые 10 мин. способствует равномерному распределению вируса между клетками.
      6. Добавьте по 900 μl дополненной среды IMDM, содержащей SCF и EPO (Таблицы 2 и 3), в каждую пробирку.
      7. Перенесите каждый образец в 6-луночный планшет и поместите в инкубатор при 37°C на 24 ч.
    • День 1: Соберите клетки в отдельные пробирки по 15 мл, центрифугируйте их при 200 g в течение 5 мин., удалите супернатант и повторите процедуру инфицирования (шаги b–g выше).
    • День 2: Промойте клетки и ресуспендируйте их в дополненной среде IMDM, содержащей SCF и EPO, в концентрации 0,2x106 клеток/мл, и далее действуйте согласно описанию в Части I.
  2. Репрезентативные результаты
    На Рисунке 6A представлена схема протокола инфицирования первичных эритроидных клеток лентивирусом с последующей экстракцией РНК. В одном из экспериментов мы инфицировали эритроидные клетки лентивирусом, продуцирующим shRNA, направленную против транскрипционного фактора TAL1, или scramble-контролем 11. Рисунок 6B показывает, что нам удалось подавить 75% транскриптов TAL1 в первичных эритроидных клетках. Также обратите внимание на повышение уровня транскриптов TAL1 с 9-го по 12-й день в группе scramble-контроля, что подчеркивает важность этого транскрипционного фактора в процессе эритроидной дифференцировки. В другом эксперименте мы инфицировали эритроидные клетки лентивирусом, экспрессирующим белок GFP. Рисунок 6C демонстрирует, что через три дня после инфицирования большинство эритроидных клеток (87%) экспрессируют GFP, что подтверждается флуоресцентной микроскопией и методом FACS. Это указывает на высокую эффективность инфицирования первичных эритроидных клеток. Ранее мы инфицировали CD34+ клетки в День 0 с аналогичной эффективностью (данные не представлены). Наиболее важным параметром для эффективной трансдукции первичных клеток является использование высокого MOI (т. е. концентрированных лентивирусов). При использовании низкого MOI (т. е. неконцентрированного вируса) эффективность трансдукции снизится.

3. Репрезентативные результаты

Схема положительной изоляции CD34+ ГСК; иммуномагнитная сепарация, бессерточная эритроидная дифференцировка.
Рисунок 1. Схема протокола изоляции и ex vivo эритроидной дифференцировки первичных гемопоэтических стволовых клеток/клеток-предшественников человека. (Этап 1) Клетки CD34+ (чистота 95 ± 3%) выделяют из пуповинной крови, костного мозга или периферической крови человека, мобилизованной с помощью G-CSF (лейкаферез), методом положительной иммуномагнитной селекции. (Этап 2) Клетки CD34+ выращивают в жидкой культуре в соответствии с указанным четырехэтапным протоколом.

График амплификации клеток; логарифмическая шкала; дни культивирования в зависимости от анализа тенденции роста клеток.
Рисунок 2. Амплификация клеток в ходе протокола эритроидной дифференцировки ex vivo. Результаты представлены в логарифмическом масштабе. Типичные результаты, полученные с использованием CD34+ клеток, выделенных методом лейкафереза.

Схема стадий эритропоэза, микрофотографии, отслеживающие развитие эритроцитов в течение 26 дней.
Рисунок 3. Морфологический анализ клеток в процессе дифференцировки эритроидных клеток ex vivo. Клетки окрашены реагентом по Май-Грюнвальду-Гимзе в указанные временные точки дифференцировки (увеличение x 40). HSC: гемопоэтические стволовые клетки/клетки-предшественники; BFU-E: эритроидные колониеобразующие единицы типа burst-forming; CFU-E: эритроидные колониеобразующие единицы; Pro EB: проэритробласты; Baso EB: базофильные эритробласты; Poly EB: полихроматофильные эритробласты; Ortho EB: ортохроматические эритробласты; RET: ретикулоциты; RBC: эритроциты.

Схема полутвердого анализа; рост клеток-предшественников CFU-GM, BFU-E, CFU-E; дни культивирования клеток; сравнение изображений.
Рисунок 4. Анализ колониеобразующих клеток (CFC) для обнаружения и количественного определения гемопоэтических предшественников. В указанные временные точки 104 клеток высевали в полутвердую среду с метильцеллюлозой в присутствии рекомбинантных человеческих цитокинов: rh SCF, rh GM-CSF, rh G-CSF, rh Il-3, rh EPO для обеспечения оптимального роста эритроидных предшественников (BFU-E и CFU-E) и гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (CFU-GM). BFU: burst forming units (единицы, образующие «вспышки»); CFU: colony forming units (колониеобразующие единицы). Также представлены типичные изображения BFU-E и CFU-E. Обратите внимание на красно-коричневый цвет, обусловленный гемоглобинизацией BFU-E и CFU-E.

Графики гемопоэтической дифференцировки, показывающие клеточные маркеры CD34, CD36, CD71, GPA, бензидин, LDS с течением времени.
Рисунок 5. Кинетика гемопоэтических/эритроидных маркеров во время эритроидной дифференцировки ex vivo. В указанные моменты времени собирали 2x105 клеток и анализировали экспрессию указанных маркеров с помощью FACS (CD34, CD36, CD71, GPA и LDS) или микроскопии (бензидин). Столбцы представляют процент положительных клеток. CD34: трансмембранный гликопротеин, присутствующий на гемопоэтических стволовых клетках/клетках-предшественниках человека; CD36: рецептор тромбоспондина, присутствующий на клетках-предшественниках; CD71: рецептор трансферрина, присутствующий на эритроидных предшественниках и ретикулоцитах; GPA: гликофорин A, присутствующий на эритроидных предшественниках и эритроцитах; Бензидин: краситель для гемоглобина; LDS: лазерный стирильный краситель, краситель для ДНК.

График инфицирования лентивирусом с shRNA, гистограмма экспрессии мРНК TAL1, микроскопия GFP, проточная цитометрия.
Рисунок 6. Лентивирусный перенос генов в первичные проэритробласты человека. (A) График индукции нокдауна (KD) TAL1 в первичных проэритробластах с использованием системы лентивирусной доставки генов. (B) Нокдаун TAL1 был осуществлен с помощью доставленной лентивирусом анти-Tal1 shRNA (TAL1 KD) или контрольной скрамблированной shRNA (Scr). Кинетика уровня транскриптов мРНК TAL1 измерена методом RT-qPCR. Экспрессия транскрипта TAL1 представлена относительно 18S RNA. (C) Доставка GFP лентивирусом была проверена с помощью микроскопии (левая панель) или FACS (правая панель). 87% клеток были GFP-положительными.

4. Материалы

РеагентИсточникНомер по каталогу
RPMI 1640 SigmaR8758
Коллагеназа BRoche Applied Science11088807001
ДНКаза ISigmaD5025-15KU
Фильтры для предварительного разделения (нейлоновая сетка 30μm)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
10-кратный буфер для лизиса эритроцитов EasySep StemCell Technologies20120
Набор микросфер CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec Inc130-046-703
Колонки LS Mini-MacsMiltenyi Biotec Inc130-042-401
Рабочий буфер autoMACS — буфер для разделения MACSMiltenyi Biotec Inc130-091-221
Сепаратор MiniMACS Miltenyi Biotec Inc130-042-102
Стромальные клетки костного мозга мыши MS-5 (регулярно проверять на контаминацию микоплазмой)DSMZACC 441
Раствор трипанового синего (0.4%)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
Трипсин 0.05%/ЭДТАThermoScientific J101521
Краситель по 방법에 Май-Грюнвальда-Гимзы Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
Среда Methocult для анализа колониеобразующих клеток (CFC) человека StemCell Technologies 04044

Таблица 1.

КомпонентСтоковый растворОбъем 600 ml
IMDMSigma I3390443.4 ml
Пенициллин/стрептомицин 1% (об/об)Gibco 103786ml
L-глутамин 4x10-3M200mM (Gibco 25030)12 ml
Инозитол 40μg/ml4mg/ml (Sigma I5125)
приготовление: Растворить 28 mg порошка в 7 ml IMDM и стерилизовать путем фильтрации — стабилен в течение 1 недели при 4°C.		6ml
Фолиевая кислота 10μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
приготовление: Растворить 7 mg порошка в 7 ml предварительно нагретого IMDM и стерилизовать путем фильтрации — стабилен в течение 1 недели при 4°C. Перед использованием предварительно нагреть.		6ml
Монотиоглицерин 1.6x10-4M0.16M (Sigma M6145)
приготовление: Растворить 10 μl стокового раствора 11.56M в 712 μl IMDM и стерилизовать путем фильтрации — стабилен в течение 1 недели при 4°C.		0.6ml
Нитрат железа(II) 90 ng/ml18μg/ml ( Sigma 8508)
приготовление: Растворить 1.8 mg в 1ml дистиллированной воды. Взять 0.1 ml, добавить 9.9 ml IMDM и стерилизовать путем фильтрации — стабилен в течение 1 недели при 4°C.		3ml
Сульфат железа(II) 900 ng/ml180 μg/ml ( Sigma F8633)
приготовление: Растворить 18 mg в 1ml дистиллированной воды. Взять 0.1 ml, добавить 9.9 ml IMDM и стерилизовать путем фильтрации — стабилен в течение 1 недели при 4°C.		3ml
Бычий сывороточный альбумин-Инсулин-Трансферрин (BIT)
20% (об/об)		StemCell Technologies 9500120 ml

Таблица 2.

КомпонентСтоковый растворОбъем для добавления в 100 ml дополненной среды IMDM (Таблица 2)
Гидрокортизон (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
приготовление: Растворить 5mg порошка в 1,03ml IMDM. Взять 0,1 ml, добавить 9,9 ml IMDM и стерилизовать фильтрованием. Стабилен в течение 1 недели при 4°C.		1ml
Фактор стволовых клеток (SCF) 100ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
приготовление: Растворить 50 μg порошка в 500 μl PBS+0,1% BSA и стерилизовать фильтрованием. Разлить на аликвоты по 100 μl и хранить при -20°C.		100 μl
Эритропоэтин (EPO) 3 IU/ml100 μg/ml, эквивалентно 12 000UI/ml (Feldan FB03-10-290)
приготовление: Растворить 50 μg порошка в 500 ml PBS+0,1% BSA и стерилизовать фильтрованием. Разлить на аликвоты по 25 ml и хранить при -20°C.		25 μl
Интерлейкин 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
приготовление: Растворить 10 μg порошка в 100 μl PBS+0,1% BSA и стерилизовать фильтрованием. Разлить на аликвоты по 5 ml и хранить при -20°C.		5 μl

Таблица 3.

РеагентИсточникСсылка/Каталог
клетки 293T
(регулярно тестировать на контаминацию микоплазмой) 		ATCCCRL-11268
DMEM/High GlucoseThermoScientificSH30243.01
Гексадиметина бромид (Полибрен)SigmaH9268-5G
пробирки для ультрацентрифугирования OptiSealBeckman Coulter361625
плазмида psPAX2Addgene (лаборатория D. Trono)12260
плазмида pMD2.GAddgene (лаборатория D. Trono)12259
плазмида pBLOCK-it6-DEST (shTal1)последовательность shRNA Tal1, клонированная в плазмиду pBLOCK-it6-DEST от InvitrogenPalii et al. EMBO J.
плазмида pBLOCK-it6-DEST (shScr)скрэмблированная последовательность shRNA, клонированная в плазмиду pBLOCK-it6-DEST от InvitrogenPalii et al. EMBO J.
плазмида pWPIAddgene (лаборатория D. Trono)12254

Таблица 4.

БуферПриготовлениеКонечная концентрация
2xHBS
  • 1.6 g NaCl
  • 1.3 g HEPES
  • 0.04 g Na2HPO4(7H2O)
  • Добавить воду Milli-Q.
  • Довести pH ровно до 7.11-7.13, добавляя раствор NaOH, и довести объем водой Milli-Q до 100 ml.
  • Окончательно отрегулировать pH до 7.11-7.13.
  • Стерилизовать фильтрацией, разделить на аликвоты по 10 ml и хранить при -20°C
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1.5 mM
CaCl2
  • 2.77 g безводного CaCl2
  • Растворить в 10 ml воды Milli-Q.
  • Стерилизовать фильтрацией, разделить на аликвоты по 1 ml и хранить при -20°C
  • 2.5M
MS30
  • 25ml [2M] Tris pH8.0
  • 5ml [0.5M] EDTA
  • 300ml глицерина
  • 50mM
  • 2.5mM
  • 30% (v/v)

Таблица 5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ряд методов были использованы ранее дифференцировать эритроидных клеток в культуре с переменным успехом. Например, некоторые протоколы без со-культуры на MS-5 позволяет расширение эритроидных клеток, но не эффективным в производстве полностью зрелых безъядерных эритроцитов 12-17. Хотя другие методы позволяют эффективно энуклеации, это за счет распространения 18,19. Метод, который мы использовали здесь, первоначально разработанный Дуэ лаборатории 6, сочетает в исходной жидкости шаг культу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы благодарим Л. Дуэ и МС Giarratana (Université Paris VI, Франция) за консультацией по бывшей естественных условиях дифференциации эритроидных, Д. Аллан и Х. Аткинс (Огржи, Канада) за предоставление образцов крови (полученные в Оттаве больницы по этике исследований Совет # 2007804-01H), Д. Trono (Ecole Polytechnique Federale Лозанны) для обеспечения лентивирусов векторов и FJ Дилворт (Огржи, Канада) для критически чтении рукописи. Этот проект был профинансирован CIHR гранта (СС-82813), чтобы MBCGP является получателем фонд Ontario вычислительный Обучение Regulomics Докторантура стипендий. МБ заведует кафедрой Канаде исследований в регуляции экспрессии генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Ссылки

  1. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  2. Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
  3. Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
  4. Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
  5. Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
  6. Giarratana, M. C. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  7. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).
  8. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
  9. Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther. 6, 673-677 (2002).
  10. Laurenti, E. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).
  11. Palii, C. G. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J. 30, 494-509 (2011).
  12. Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood. 73, 100-103 (1989).
  13. Wada, H. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood. 75, 505-511 (1990).
  14. Sui, X. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med. 183, 837-845 (1996).
  15. Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood. 92, 3658-3668 (1998).
  16. Lindern, M. von The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood. 94, 550-559 (1999).
  17. Freyssinier, J. M. amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).
  18. Malik, P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood. 91, 2664-2671 (1998).
  19. Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 103, 4310-4316 (2004).
  20. Mazurier, F. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther. 5, 556-562 (1998).
  21. Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Выделение CD34-положительных клетоксовместное культивирование со стромальными клеткамипротокол лентивирусного зараженияанализ экспрессии GFPвалидация нокдауна методом RT-qPCRтранскрипционный фактор TAL1протокол эритроидной дифференцировки
Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.