Трансдукция клеток человека с Полимер-комплекс Ecotropic лентивирус для работы с улучшенными биобезопасности

Краткое содержание

Лентивирусов являются ценным исследовательским инструментом для изучения функции генов, однако, исследователи, возможно, пожелают, чтобы избежать производства пантропный кодирования лентивирус известных или подозреваемых онкогенов. В качестве альтернативы, мы представляем безопаснее протокол для использования ecotropic лентивирус на клетки человека изменен, чтобы выразить ecotropic mSlc7a1 рецепторов.

Аннотация

Исследования биологии стволовых клеток и опухолевых клеток часто требуют вирусной трансдукции человеческих клеток известными или предполагаемыми онкогенами, что создает серьезные проблемы безопасности для персонала лаборатории. Пантропные лентивирусы, такие как широко используемый псевдотип VSV-G, являются ценным инструментом для изучения функций генов, поскольку они способны трансдуцировать многие типы клеток, включая неделящиеся. Однако исследователи могут стремиться избежать производства и центрифугирования пантропных вирусов, кодирующих онкогены, из-за требований к более высокому уровню биологической безопасности и сопутствующих рисков. Известно, что несколько мощных онкогенов, включая c-Myc и большой Т-антиген SV40, усиливают получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Все остальные известные генетические изменения, индуцирующие iPSC (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28 и потеря функции p53), также связаны с раком, что делает их использование относительно опасным с точки зрения безопасности.

Хотя эти вирусы, связанные с раком, полезны при изучении клеточного перепрограммирования и плюрипотентности, их необходимо использовать безопасно. Чтобы решить эти вопросы биобезопасности, мы демонстрируем метод трансдукции клеток человека экотропным лентивирусом, уделяя особое внимание снижению затрат и удобству работы. Мы получили экотропный лентивирус с достаточно высоким титром для трансдукции более 90% экспрессирующих рецептор клеток человека, подвергнутых воздействию вируса, что подтверждает эффективность данного подхода.

Лентивирусы часто концентрируют с помощью ультрацентрифугирования; однако этот процесс занимает несколько часов и может привести к образованию аэрозолей, представляющих инфекционную опасность для биомедицинских исследователей. В качестве альтернативы вирусные частицы можно более безопасно осаждать на клетки путем комплексообразования с хондроитинсульфатом и полибреном (CS/PB). Данный метод увеличивает функциональный вирусный титр в клетках, стабильно экспрессирующих рецептор мышиного ретровируса, до 3 раз при незначительных дополнительных затратах времени и средств. Трансдукция дермальных фибробластов человека (HDF) максимально усиливается при использовании концентраций CS/PB примерно в 4 раза ниже оптимального значения, ранее зарегистрированного для линий раковых клеток, что указывает на необходимость титрования концентрации полимера для конкретного целевого типа клеток. В связи с этим мы описываем использование бромтионитрилтетразолия (MTT) для оценки токсичности полимера в новом типе клеток. Мы наблюдаем эквивалентную жизнеспособность HDF после вирусной трансдукции с использованием как комплексообразования с полимером, так и стандартной дозы полибрена (PB, 6 μg/ml), что свидетельствует о минимальной острой токсичности.

В данном протоколе мы описываем использование экотропного лентивируса для гиперэкспрессии онкогенов в клетках человека, что позволяет снизить риски биобезопасности и повысить эффективность трансдукции. Мы также демонстрируем применение полимерной комплексации для усиления трансдукции, позволяющее избежать центрифугирования вирусных частиц с образованием аэрозолей.

Протокол

1. Производство, сбор и замораживание лентивируса

1. Перед началом данного протокола проконсультируйтесь со специалистом по технике безопасности вашего учреждения и следуйте его рекомендациям.
2. День 1. Для производства вируса используйте здоровые, быстро растущие клетки 293T. Высейте клетки из расчета 5 x 10⁶ клеток на чашку диаметром 10 см. Для производства вируса используйте среду для клеток 293T без антибиотиков (DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% FBS и 4 мM L-глутамина).
3. День 2. Поздним вечером проведите трансфекцию клеток 293T следующим образом (указанные количества приведены для одной чашки 10 см). Доведите все реагенты до комнатной температуры. Пипетируйте 375 μl OptiMEM в микроцентрифужную пробирку, затем добавьте 25 μl Fugene HD. Не допускайте контакта неразведенного Fugene с поверхностью пробирки.
4. В микроцентрифужной пробирке смешайте:
   • 5 μg трансфертной плазмиды (Slc7a1, целевого вектора или флуоресцентного контрольного вектора)
   • 3,75 μg упаковочной плазмиды (pCMV-dR8.91 или psPax2)
   • 1,25 μg плазмиды оболочки (pMD2.G для пантропного, pHCMV-EcoEnv для экотропного вируса)
   • безсывороточный OptiMEM до объема 100 μl
5. Объедините содержимое двух пробирок и инкубируйте смесь 20-30 минут при комнатной температуре.
6. Замените среду в культурах клеток 293T на 10 ml свежей среды для 293T без антибиотиков. Добавьте смесь Fugene/плазмид по каплям в чашку и инкубируйте в течение ночи при 37°C, 5% CO₂.
7. День 3. Замените среду в культурах клеток 293T на 10 ml свежей среды для 293T без антибиотиков. Действуйте осторожно, так как клетки 293T прикрепляются слабо и могут отслоиться, если пипетировать среду слишком интенсивно на монослой. Инкубируйте в течение двух дней в увлажненном инкубаторе для производства вируса.
8. День 5. Соберите вирус и профильтруйте через фильтр с порами 0,45 mm с низкой связью с белками. Используйте немедленно или разлейте по однократным аликвотам и заморозьте при -80°C. Замороженный пантропный и экотропный вирус следует повторно титровать после хранения в течение шести месяцев и одного месяца соответственно.
9. Титруйте вирус следующим образом, используя клетки, которые относительно восприимчивы к трансдукции. Трансдуцируйте клетки флуоресцентным контрольным вирусом в течение ночи, используя серийные разведения (например, 1:10, 1:100, 1:1000) в свежей среде с 6 μg/ml PB. На следующий день замените среду на свежую. После трансдукции подождите два дня, чтобы клетки начали экспрессировать флуоресцентный белок, затем определите долю трансдуцированных клеток с помощью FACS. Рассчитайте титр в трансформирующих единицах (TU) на мл, основываясь на разведениях, при которых уровень трансдукции составляет < 15%, чтобы минимизировать события множественной трансдукции.
   

2. Трансдукция мишеней — клеток человека рецептором мышиного ретровируса Slc7a1

1. Выберите множественность заражения (MOI) = 2, чтобы обеспечить трансдукцию большинства клеток. Для клеток-мишеней, устойчивых к трансдукции, таких как HDF, потребуется более высокая MOI; в таких случаях мы разводим вирусный супернатант в соотношении 1:2, чтобы добиться трансдукции большинства клеток.
2. Проведите трансдукцию клеток-мишеней вирусным супернатантом, разведенным в свежей культуральной среде с добавлением 6 μg/ml PB, в течение ночи; это повышает эффективность трансдукции за счет усиления электростатического взаимодействия между вирусом и клеткой-мишенью.¹ В идеале следует использовать минимальный объем вируса, например, 1 ml для чашки диаметром 35 mm, так как диффузия является лимитирующим фактором эффективности трансдукции.
3. После удаления вируса культивируйте клетки в течение как минимум 48 часов перед их трансдукцией экотропным вирусом, чтобы обеспечить достаточный уровень экспрессии рецептора Slc7a1.
4. (Опционально) При необходимости можно использовать бластицидин для селекции стабильно трансдуцированных клеток, экспрессирующих Slc7a1. Заранее следует построить кривую гибели при воздействии бластицидина, чтобы определить минимальную эффективную концентрацию (обычно от 2 до 10 μg/ml), которая приводит к гибели всех нетрансдуцированных клеток-мишеней в течение 7 дней. Примерно через 2 дня после удаления вируса Slc7a1 перенесите трансдуцированные клетки в среду, содержащую бластицидин. Культивируйте клетки в среде с бластицидином в течение 7 дней; к этому моменту все оставшиеся клетки будут стабильно экспрессировать ретровирусный рецептор, что позволит трансдуцировать их экотропным вирусом, а также законсервировать их для последующего использования в качестве стабильной линии, экспрессирующей Slc7a1.

3. Титрование полимерного комплекса для определения токсичности

1. День 1. Высейте клетки в 96-луночный планшет с плотностью 5000 cells/well, обеспечив как минимум три повторности для каждой экспериментальной группы. Включите нетрансдуцированные клетки в полной среде для получения базового значения для здоровых клеток, а также образцы клеток в безсывороточной среде для индукции остановки роста в качестве контроля. Параллельно высейте клетки в подходящем формате (например, в 24-луночный планшет) для микроскопического анализа или анализа методом FACS с целью определения эффективности трансдукции в каждом экспериментальном условии.
2. День 2. Трансдуцируйте клетки в планшетах, подготовленных как для МТТ-теста, так и для FACS-анализа, вирусом, кодирующим GFP, при MOI 0,5 для трансдукции ~40% целевых клеток. Протестируйте различные концентрации CS/PB (например, 50, 100, 200, 400, 600 и 800 mg/ml каждого компонента), а также 6 μg/ml PB, чтобы определить оптимальные количества. Получите полимерные комплексы, как описано в Части 4 ниже.
3. День 3. Удалите среду, содержащую вирус, и замените ее свежей средой. Верните планшеты в увлажненный инкубатор.
4. День 5. Проанализируйте планшет для FACS, чтобы определить эффективность трансдукции при каждой концентрации полимера.
5. День 6. Удалите среду из всех лунок планшета для МТТ-теста и замените ее 100 μl раствора MTT (1 mg/ml MTT в полной среде). Культивируйте в течение трех часов в увлажненном инкубаторе, чтобы MTT восстановился в митохондриях метаболически активных клеток.
6. Удалите раствор MTT и замените его 200 ml растворителя MTT (0,1 N HCl, 0,1% Igepal CA-630 в изопропаноле).
7. Инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре или до полного растворения фиолетового осадка формазана MTT. Измерьте абсорбцию на микропланшетном ридере при 570 nm, вычитая фоновое значение при 690 nm.
8. Выберите оптимальную концентрацию полимера, которая обеспечивает максимальное усиление трансдукции (по данным FACS) при минимальном влиянии на метаболическую активность (по данным МТТ-теста). Для HDFs мы выбрали 100 μg/ml CS/PB на основании данных, представленных в Типичных результатах ниже.

4. Экотропная трансдукция с использованием полимерного комплексообразования

1. Приготовьте стерильно фильтрованные стоковые растворы PB и хондроитинсульфата в концентрации 20 mg/ml в воде. Разлейте по аликвотам и храните при -20°C.
2. Перенесите супернатант вируса в микроцентрифужную пробирку и разведите до желаемой конечной концентрации (например, MOI 2) свежей культуральной средой. Последовательно добавьте равные объемы PB и хондроитинсульфата (концентрации которых определены в шаге 3 выше), осторожно встряхивая пробирку для перемешивания после каждого добавления. Вирусная смесь мгновенно станет мутной из-за образования преципитатов. Инкубируйте вирусную смесь при комнатной температуре в течение 5 минут для формирования комплексов.
3. Удалите среду из целевых клеток, экспрессирующих рецепторы, замените ее вирусной смесью и инкубируйте в течение ночи при 37°C и 5% CO2. После удаления вирусной смеси дважды промойте поверхность клеток PBS, чтобы помочь удалить вирусные комплексы. Полное удаление не обязательно; нами не было отмечено отрицательного влияния остаточных полимерных комплексов на жизнеспособность клеток.

5. Проверка специфичности экотропной трансдукции

1. При первом производстве экотропного вируса с точки зрения безопасности целесообразно убедиться, что вирус не способен трансдуцировать немодифицированные клетки человека. Проведите трансдукцию клеток человека экотропным лентивирусом в относительно высокой концентрации (разведение вирусного супернатанта в свежей среде всего в 1–2 раза) в течение ночи, используя 6 μg/ml PB или оптимизированную концентрацию CS/PB.
2. Удалите среду, содержащую вирус, и замените ее свежей средой. После инкубации клеток в течение 2 дней подтвердите экспрессию трансгена с помощью FACS с использованием флуоресцентных векторов и/или методом RT-PCR с использованием праймеров, специфичных к трансгену.

6. Репрезентативные результаты:

На рис. 1A показан процесс получения лентивируса, а на рис. 1B — трансдукция человеческих клеток экотропным лентивирусом, включая предварительную трансдукцию рецептором мышиного ретровируса Slc7a1. Для определения титра вируса мы используем линию клеток рабдомиосаркомы человека, стабильно трансдуцированных Slc7a1 (Slc-hRMS). При использовании флуоресцентных контрольных векторов для мониторинга эффективности трансдукции мы обычно достигаем эффективности трансдукции Slc-hRMS экотропным вирусом > 90%, как показано на рис. 2A и 2B. Степень трансдукции HDF обычно ниже, поскольку клетки не проходили селекцию бластицидином на экспрессию рецептора (рис. 2C). Титры экотропного лентивируса при измерении на Slc-hRMS обычно составляют 10-20% от титров вируса, псевдотипированного VSV (рис. 2D).

Один цикл замораживания-оттаивания снижает титр экотропного вируса на 16–3%, что эквивалентно потере титра при одном цикле замораживания-оттаивания вируса, псевдотипированного VSV (p > 0.05). Вопреки предыдущим сообщенияниям,² мы не обнаружили положительного влияния экспресс-замораживания в сухом льду на титр вируса. Напротив, более высокие титры обоих псевдотипов после оттаивания были достигнуты путем простого помещения пробирок с вирусом в морозильник при -80°C (данные не представлены).

Анализ жизнеспособности с помощью МТТ позволяет чувствительно определить остановку роста в целевых клетках. Трансдукция вирусом в сочетании с концентрациями CS/PB до 800 μg/ml не оказывает влияния на метаболизм HDF (рис. 3A). Воздействие CS/PB без вируса также не вызывает токсического эффекта в клетках (данные не представлены). Анализ FACS клеток HDF, трансдуцированных вирусом с различными концентрациями CS/PB, показывает усиление трансдукции по сравнению с использованием только PB (рис. 3B). Максимальное усиление наблюдается при 100 μg/ml CS/PB (рис. 3C), что в несколько раз ниже значений, сообщавшихся ранее.³ Таким образом, важно оптимизировать условия для каждого конкретного типа целевых клеток.

Комплексообразование с CS/PB примерно в 3 раза увеличивает наблюдаемый титр в Slc-hRMS (рис. 4A, p < 0,01). На практике это дает более выраженный эффект на эффективность трансдукции при низких концентрациях вируса, чем при более высоких (рис. 4B), что, скорее всего, обусловлено множественной трансдукцией клеток и насыщением рецепторов при более высоких концентрациях вируса.

Трансдукция экотропным вирусом специфична для клеток, экспрессирующих рецептор мышиного ретровируса. При трансдукции немодифицированных человеческих клеток экотропным вирусом мы не наблюдали флуоресценции выше фона нетрансдуцированных клеток ни при использовании PB, ни при использовании CS/PB, как показано на рис. 5A. При микроскопическом исследовании HDF не проявляют признаков трансдукции в отсутствие рецептора (рис. 5B), в то время как предварительная трансдукция рецептором приводит к появлению флуоресцентных клеток (рис. 5C).

Рисунок 1. Схематическое изображение (A) процесса производства вируса и (B) трансдукции клеток человека рецептором мышиного ретровируса с последующим введением экотропного лентивируса.

Рисунок 2. Высокоэффективная трансдукция клеток человека экотропным лентивирусом, кодирующим GFP. Клетки были предварительно трансдуцированы рецептором мышиного ретровируса Slc7a1. (A) Линия клеток рабдомиосаркомы человека, отобранная с помощью бластицидина на экспрессию Slc7a1 (Slc-hRMS), трансдуцированная (синий цвет) или нетрансдуцированная (розовый цвет) GFP. (B) Флуоресцентная микрофотография экотропно-трансдуцированных клеток Slc-hRMS (4X). (C) HDF, трансдуцированные (синий цвет) и нетрансдуцированные (розовый цвет) экотропным лентивирусом GFP; трансдукция клеток Slc7a1 проводилась за два дня до экотропной трансдукции. (D) Титр VSV-G-псевдотипированного и экотропного лентивирусов, измеренный на клетках Slc-hRMS.

Рисунок 3. Оптимизация концентраций хондроитинсульфата/полибрена (CS/PB) в дермальных фибробластах человека. (A) Жизнеспособность HDF, измеренная с помощью МТТ-теста после трансдукции только с PB или с различными концентрациями CS/PB. (B) Повышение эффективности трансдукции в HDF при различных концентрациях CS/PB, измеренное методом FACS. (C) Количественная оценка повышения трансдукции, показывающая, что максимальная трансдукция наблюдается при 100 μg/ml CS/PB.

Рисунок 4. Влияние 400 μg/ml CS/PB на трансдукцию Slc-hRMS экотропным лентивирусом. (A) Повышение титра и (B) кратность изменения скорости трансдукции по сравнению с использованием только 6 μg/ml полибрен.

Рисунок 5. Отсутствие экотропной трансдукции HDF при отсутствии рецептора мышиного ретровируса Slc7a1. (A) Диаграмма FACS фибробластов человека линии BJ, нетрансдуцированных (розовый) или трансдуцированных (синий) экотропным лентивирусом GFP, в обоих случаях при отсутствии рецептора Slc7a1. Фибробласты человека BJ, трансдуцированные экотропным лентивирусом GFP, без (B) и с (C) предварительной трансдукцией рецептором Slc7a1 (4X).

Обсуждение

Рекомбинантный ecotropic gammaretrovirus на основе Молони мышиного вируса лейкоза (MLV) и его рецептор mSlc7a1 хорошо изучены и широко доступны, что оно использовалось более 20 лет для доставки трансгенов в мышиных клетках. Ecotropic gammaretrovirus также используется в последнее время для доставки онкогенов в клетках человека;. В контексте сотовых перепрограммирования, использование mSlc7a1, чтобы избежать поколения amphotropic вирус укрывательство человека онкогенов хорошо известна ^4,5 Тем не менее, лентивирус обеспечивает значительные преимущества по сравнению с gammaretrovirus В трансдуцирующих огнеупорных клеточных популяций, ^6, включая первичные клетки, которые часто желательно цели для перепрограммирования, так как лентивирусов предварительной интеграции комплекса позволяет трансдукции, не делящихся клеток. ⁷

Лентивирусов были произведены с десятками различных pseudotypes, в том числе MLV, в попытке изменить вирус тропизм, токсичность и другие свойства. ⁸ MLV-pseudotyped ecotropic лентивирус была использована для трансдукции клеток мыши, ^9, но редко используется на клетки человека ^10. Поэтому мы предлагаем использование MLV-pseudotyped ecotropic лентивирус как безопасный, экономичный и высокоэффективный автомобиль для доставки известных или подозреваемых онкогенов, в том числе сотовых перепрограммирования факторов, в клетках человека.

Важно отметить, что этот протокол не полностью избавляет от необходимости производить и использовать пантропный лентивирус, а, скорее, этот протокол отделяет онкоген (ы) из пантропный вирус, изоляционные исследователей из потенциальных самостоятельной прививки связанных с раком вирусов. MSlc7a1 белка и его гомолог человеческого hSlc7a1 являются повсеместно выразил аминокислоты перевозчиков кислоты, не известны туморогенность или способность даровать селективное преимущество роста на клетки-реципиенты, ¹¹ решений mSlc7a1 сравнительно низким уровнем риска для включения в amphotropic вируса. Это добавило шаг может быть особенно полезным в лабораториях не хватает посвященный вирусу или объектов культуры тканей необходимого уровня биобезопасности.

В некоторых ситуациях это может быть возможным, чтобы полностью отказаться от использования пантропный вируса путем трансфекции плазмидой Slc7a1 непосредственно в клетки-мишени, однако многие клетки, которые были бы полезными целями этой техники также поддаются трансфекции. В качестве альтернативы, способность изолировать Slc7a1-трансдуцированных клеток выбор blasticidin означает, что VSV-G pseudotyped лентивирус может быть использован только один раз, чтобы создать запас рецепторами клеток, экспрессирующих, после чего ecotropic вирус может быть использован для трансдукции обычно эти клетки для многих экспериментов. Исследователи должны всегда следовать их институциональных правил техники безопасности при работе с любым лентивирус, независимо от его тропизм.

Титры ecotropic вируса достигнуты с этим протоколом умеренно ниже, чем VSV-pseudotyped вирус, как правило, 10-20% пантропный титр вируса, в соответствии с предыдущими исследованиями. ⁹ Эти титры были измерены в клетках человека стабильно трансдуцированных с Slc7a1, так что нижняя наблюдается титр для ecotropic вирус может быть частично обусловлено разнообразными экспрессии рецептора гена в клетки-мишени. Тем не менее, вирусные титры достигнута в наш протокол более чем достаточно для большинства приложений и привести к трансдукции большинства клеток, в некоторых случаях> 90% клеток.

Центрифугирование методы на основе широко используются для сконцентрироваться вирусных частиц. Тем не менее, центрифугирования требует нескольких часов, генерирует инфекционных аэрозолей, и может привести к значительной потере вирусных частиц. ¹² В качестве альтернативы, комплексообразование с НЦБ / PB может быть использован для повышения трансдукции без изменения вирусной тропизм. ³ Этот метод быстрого (5 минут ) и недорогая ($ 0,03 за 10 мл вируса), в то время как примерно в три раза наблюдалось титр. Никакого специального оборудования или собственности реагенты необходимы, и мы наблюдали минимальную острую токсичность после воздействия HDFS для CS / PB, по согласованию с предыдущей работы в других клеточных линий. ¹³ Одним из потенциальных недостатков этого протокола является то, что некоторые микроскопически видимые полимерных комплексов придерживаться клетки в течение нескольких дней в культуре. Мы не можем исключить возможность того, что эти комплексы, а не открыто токсичны для клеток, может иметь более тонкие эффекты на клеточные процессы.

Здесь мы описали методологию безопасно и эффективно трансдуцирующих человеческие клетки с онкогенными факторами. Этот подход должен быть очень утилита для исследователей, изучающих онкогенов и биологии стволовых клеток, в том числе плюрипотентных клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Мышей рецептор MLV
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G конверте
pCMV-dR8.91	Д. Trono лаборатории 14		Упаковка плазмиды (эквивалент плазмиды psPax2 можно получить Addgene, Кат. Количество 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropic конверте
FUGW	Addgene	14883	GFP контроль плазмиды
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimethrine бромид (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Хондроитин сульфат натрия соли из акульего хряща	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Рыболов	ВР 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-тетразолия бромид (МТТ)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021