Эта статья представляет проточная цитометрия основе метод для исследования иммунного состав аорты. Документ также показывает дополнительную технику, которая позволяет изучения окружающих и адвентиции стенки сосуда отдельно. Этот метод открывает возможности для выполнения фенотипических анализов аорты лейкоцитов и применить несколько иммунологических анализов для исследования атеросклероза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Атеросклероз является хроническим воспалительным процессом среднего и большого размера судов, которое характеризуется образованием бляшки, состоящие из пены клетки, клетки иммунной системы, сосудистых эндотелиальных и гладкомышечных клеток, тромбоцитов, внеклеточного матрикса и богатых липидами ядро с обширным некрозом и фиброз окружающих тканей. 1 врожденного и адаптивного руки иммунном ответе принимают участие в инициировании, разработке и настойчивость атеросклероза. 2, 3 Существует значительное количество доказательств того, что различные подмножества иммунных клеток, таких как макрофаги, дендритные клетки, Т-и В-лимфоцитов, присутствуют в пределах здоровых аорты и атеросклероз подверженных мышей 4. Кроме того, клетки иммунной системы находятся в окружающем аорты адвентиции что предполагает важную роль этой ткани в атерогенеза 2.
В течение некоторого времени, количественного определения различных типов иммунных клеток, их статус активации и клеточного состава в стенке аорты была ограничена RT-PCR и иммуногистохимических методов исследования атеросклероза. Мало были предприняты попытки выполнить проточной цитометрии с использованием человеческой аорты, а также ряд проблем, таких как высокая аутофлюоресценция, были зарегистрированы 5,6. Человек атеросклеротических бляшек переваривали коллагеназы 1, а свободные ячейки были собраны и окрашены для CD14 + / + CD11c выделить макрофагами клеток, полученных из пены. В этом исследовании, "ложный" канал используется, чтобы избежать ложноположительных окрашиванию. 6 некротические материалов накапливается в процессе пищеварения приводят в большое количество мусора, который генерирует высокий аутофлюоресценция в аорте образцов. Чтобы решить эту проблему, группа отрицательный и положительный контроли была предложена, но только двойного окрашивания могут быть применены в этих образцах. Мы разработали новый проточной цитометрии Метод, основанный 7 для анализа иммунных клеточного состава и характеризуют активации, пролиферации, дифференцировки клеток иммунной системы у здоровых и атеросклероза подверженных аорты. Этот метод позволяет исследовать иммунную состав ячейки стенки аорты и открывает возможности использования широкого спектра иммунологические методы исследования иммунной аспекты этого заболевания.
Протокол
1. Выделение мышиной аорты
Институциональный комитет IACUC утверждении процедуры, необходимые для работы с мышами.
- Подготовка heparinzed PBS путем добавления 1000 единиц гепарина натрия до 50 мл PBS и обращения трубки перемешать. Подготовка пустые трубки коллекцию для крови и сбор трубки, содержащей PBS для каждого аорты должны быть собраны. Держите все пробирки на льду.
- Heparinize шприц для забора крови (0,1 мл на 1000 ед / мл гепарина натрия), подготовить хирургических инструментов (две пары изогнутых щипцов, пару рассечение ножницами, и пару микросдвигов), а рассекает сцену для вскрытия.
- Эвтаназии мыши пр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы представляем потока цитометрии Метод, основанный на исследовании иммунного клеточного состава мышиных аорты. Основным преимуществом этого метода является способность анализировать аорты иммунных клеток на одном уровне клеток и, чтобы охарактеризовать состояние активации аорты лейкоцитов. Этот метод не ограничивается мышиной аорты и мы (неопубликованные данные) и др. 10 использовали этот подход для анализа человеческих образцов, таких как внутренней грудной артерии, аортального клапанов и коронарных а.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья гранта: PO1 HL55798 (в КЛ) и Американской кардиологической ассоциации ученых грантов на цели развития 0525532U (Е. Г.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Материал | Номер в каталоге | Компания | |
| Коллагеназа XI | C7657 | Sigma-Aldrich | |
| Гиалуронидаза | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| ДНКазы I, тип 2 | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Я Коллагеназа | C0130 | Sigma-Aldrich | |
| Коллагеназы II | LS004174 | Уортингтон Биохимические корпорации | |
| Эластазы | LS002292 | Уортингтон Биохимические корпорации |
Ссылки
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Hansson, G. K., Libby, P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
