Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внутрипросветный средней мозговой артерии (MCAO) Модель развития ишемического инсульта с лазерной допплеровской флоуметрии Руководство у мышей

51.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/2879

⸱

8 мая 2011 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Внутрипросветный средней мозговой артерии (MCAO) модель является наиболее часто используемой моделью среди экспериментальных моделях ишемического инсульта. Здесь мы покажем всей модели в деталях с проводником лазерной доплеровской флоуметрии, и результаты ее представитель.

Аннотация

Инсульт является третьей ведущей причиной смерти и ведущей причиной инвалидности в мире, по оценкам, стоимость около $ 70 млрд. в Соединенных Штатах в 2009 году 1,2. Внутрипросветный средней мозговой артерии (MCAO) модель была разработана Коидзуми 4 в 1986 году для имитации этого впечатляющие патологии человека в крысу. Модификация метода MCAO позже представленных Лонга 3. Оба метода широко используются для определения молекулярных механизмов повреждения мозга в результате ишемического инсульта и потенциальные терапевтические методы 5. Этот относительно неинвазивный метод у крыс был расширен для использования на мышах, чтобы воспользоваться трансгенных и нокаут штаммов 6,7. Для моделирования координационного церебральная ишемия, внутрипросветного шов с помощью передовых внутренней сонной артерии, чтобы закупорить базе MCA. Втягивания шва после определенного периода времени имитирует спонтанной реперфузии, но шов может также быть постоянно сохранена. Это видео будет демонстрировать двух основных подходов к проведению процедуры внутрипросветный MCAO у мышей в ступенчато, а также предоставляет информацию для потенциальных недостатков и ошибок. Ишемический мозговой ткани впоследствии будет запятнана 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида (ТТК), чтобы оценить степень инфаркт мозга 8.

Протокол

Этот протокол был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) при университете Флориды и в соответствии с "принципом ухода животных Лаборатория" (NIH публикация № 86-23, пересмотренная 1985).

1. Материалы

  1. Животные: Мужской мышей C57BL / 6 (Харлан Laboratories, Индианаполис, Индиана, США) весом 20-26 граммов на время операции.
  2. Анестезия:
    1. Анестезия машины: VetEquip ингаляционной анестезии системы (VetEquip Inc, Плезантон, Калифорния, США).
    2. Вдыхание анестезии: изофлюрана (Baxter Фармацевтика, Дирфилд, штат Иллинойс).
  3. Хирургические инструменты: ножницы SuperCut Ирис, прямая (инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида, США); Vannas микро-ножницы, прямые (Всемирный инструменты Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида, США), Дюмон щипцы (штраф наконечник, 45 ° изогнутые советы, инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида, США); Биполярный коагуляции единицы (High Эксикатор частот 900, инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида, США), микро-клип судна (инструменты Всемирного Precision, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США)
  4. Хирургические расходные материалы: Стерильные советы хлопка, салфетки, марлевые губки; Шовный (7-0 шелковый шов, Ethicon, Inc Сомервилл, Нью-Джерси, США), ткани клей (Vetbond, 3M Компания, Санкт-Пол, Миннесота, США); Хирургическое скраб : Bethadine, 70% этанола и стерильным 0,9% физиологического раствора; глаз мазь (Puralube Vet Мазь, Pharmaderm, Мелвилл, штат Нью-Йорк, США).
  5. Окклюзия шва подготовки к MCAO:
    1. Накаливания для MCA окклюзии: 7-0 хирургических шовных мононити Нейлон (Ethicon, Inc Сомервилл, Нью-Джерси, США).
    2. Источник тепла для притупления шва наконечник (тепловая единица Прижигание, Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида).
    3. Жидкий силиконовый каучук (силиконовый клей RTV, Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США).
  6. Хирургическое / Пройдя микроскопа (Leica Стереомикроскоп MZ6).
    1. Волоконно-оптический осветитель (волоконно-оптический осветитель FO1-150, TechniQuip Corp, Ливермор, Калифорния, США).
  7. Лазерной допплеровской флоуметрии (PeriFlux System 5000, Perimed, Стокгольм, Швеция).
    1. Гибкая микроострийных (MT B500-0 Прямо микроострийных, Perimed, Стокгольм, Швеция)
  8. Температура параметров:
    1. Ректальные мониторинга температурных показателей (BAT-12, инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида).
    2. Тепловая одеяло (Т / НАСОС, TP600, Гаймар, Нью-Йорк, США).
  9. Окрашивание и количественного измерения объема инфаркта:
    1. 2% раствор 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида (2% TTC, Sigma-Aldrich Ко, Сент-Луис, штат Миссури, США).
    2. Мыши мозга матрицы слайсер (Живич-Миллер Lab., Inc, Эллисон-Парк, Пенсильвания, США).
    3. Цифровая камера (V1253, Kodak Ко, Рочестер, штат Нью-Йорк, США).
    4. Изображение J программное обеспечение (ImageJ 1.42q программного обеспечения, американского Национального Института Здоровья, Bethesda, штат Массачусетс, США).

2. Предоперационная шаги

  1. До операции, мыши расположены под 12:12 светлый / темный цикл со свободным доступом к воде и грызунов чау.
  2. Швы для MCAO готовятся притупление 1-2мм от шва наконечник с тепло-и покрытие 3-4мм шовного вал из его кончик с жидкого силиконового каучука, что позволяет ему высохнуть (7-0; диаметр кончика, 0.20-0.25 мм; покрытие длины, 3-4мм; шов длиной 11-13мм). Стерильность должна быть сохранена во всех вышеупомянутых шагов.
  3. После взвешивания мыши, анестезия индуцирована с 4% в изофлуран индукции камера и поддерживается во время процедуры с 1,5-2% изофлуран в 30% O 2 и 70% N 2 O газовой смеси через маску.
  4. Мышь находится в положении лежа на марлевую прокладку лежал на контролируемой температурой рабочей поверхности (тепловое одеяло); голова бритая мех.
  5. Мазь Смазка офтальмологического наносится на оба глаза и веки закрыты, чтобы предотвратить высыхание глаза во время хирургического процесса.
  6. Средней линии разреза (1 см) производится на кожного покрова черепа вышестоящими затылочной линии Насьон и кожа натягивается сбоку, чтобы прикрепить гибкой микроострийных (MT B500-0 Прямо микроострийных; 0,5 мм в диаметре). Микроострийных находится перпендикулярно к поверхности правой теменной черепа (1 мм задняя и 5 мм латеральнее брегмы) для мониторинга кровотока в СМА на территории лазерной допплеровской флоуметрии.
  7. Убедитесь, что гибкий микроострийных крепится к черепу твердо перед животное превратилось в лежачем положении. Шее животного помещается на мягкой подкладке и его нос проходит в носовой обтекатель аппарата анестезии. В результате будет иметь достаточно места для гибких микроострийных.
  8. Ректального датчика температуры вводится для поддержания постоянной температуры тела животного на 37 ± 0,5 ° С.
  9. Обе передние лапы и hindpaws выявляются в операционную платформу поверхности, и хвост, приклеенный к ректальной трубки.

    10. 3. MCA окклюзии хирургии:

    1. Под операционным микроскопом, средней линии шеи разрез производится с помощью ножниц между рукояткой и челюсть, осторожно подъема свободной кожи.
    2. Парных основных подчелюстной железы прямо разделены, с левой железы левой на месте. Правый подчелюстной железы убирается краниально и закреплены вместе с кивательной мышцы.
    3. Подвергаются разделению omohyoid мышц покрытия оболочки сонной тщательно разделить с датчиков.
    4. Право общей сонной артерии (ССА), тщательно отделены и изолированы от блуждающего нерва и его оболочки (расположен сбоку от ОАС).
    5. Далее, 2 хирургических методов, которые использовались часто для выполнения MCA окклюзии расходятся:

    4 Коидзуми метод

    1. Три свободные швы воротника (7-0 шелк) готовятся вокруг правой ОСА.
    2. Внешней сонной артерии (ЭКА) отождествляется, изолированных и обезболивающий укол (2-3мм дистальнее бифуркации). Это может быть впоследствии разделена с микро-ножниц. Чтобы избежать случайных повреждений при периферической прижигание сайта, власть должна быть установлена ​​на уровне 1, используя мощности ручки. Это соответствует для всех cauterizations.
    3. Достаточное натяжение применяется к наиболее проксимальный шов на воротнике ОСО, чтобы закупорить кровоток (постоянные перевязки). Поток окклюзии проверяется ~ 50% падения базовых значений корковой перфузии.
    4. Затем судно клип помещается непосредственно перед бифуркации ОСА, чтобы избежать ретроградного потока во время arteriotomy.
    5. Arteriotomy осуществляется между проксимальным лигируют шва и судно клипа на ОСО с микро-ножницы (ближе к перевязке).
    6. Тепло-притупляются силиконовым покрытием нейлона 7-0 шва вводят через arteriotomy и передовых, пока не достигнет судно клипа. 2 оставшиеся свободные швов воротник слегка затянуть вокруг ОСО между arteriotomy и судно клипа, чтобы избежать обратного потока утечки через ОСО, с осторожностью, чтобы не травмировать стенки артерий, а затем судно Клип снят.

    3 Лонга Метод

    1. ЭКА определена, расчлененный как можно больше (вблизи ее бифуркации на язычной и верхнечелюстной артерий), обезболивающий укол (с силовой агрегат к 1), и делится с микро-ножниц.
    2. Две свободные нити воротника (7-0 шелк) готовятся вокруг проксимальных ICA чуть выше бифуркации ОСА.
    3. ОСО временно закрыт с судна клипа. Поток окклюзии проверяется ~ 50% падения базовых значений корковой перфузии.
    4. Затем ICA временно закрыт с судна клип выше два свободных воротник швы, чтобы избежать ретроградного потока во время arteriotomy.
    5. Arteriotomy осуществляется с помощью микро-ножницы в отраженном ЭКА близки к пню.
    6. Тепло-притупляются силиконовым покрытием нейлона 7-0 шва вводят через arteriotomy в странах ЕЦА и передовых, пока не достигнет прикладной судна клип в ICA. 2 свободные швы воротника в проксимальных ICA мягко ужесточили вокруг проксимальных ICA, чтобы избежать рефлюкса кровотока через ICA, с достаточно внимания, чтобы не травмировать стенки артерий, а затем судно Клип снят.

    Дальнейшая процедура во многом сходится:

    1. Окклюзии шов медленно продвигались по внутренней сонной артерии (ВСА) в сторону основания черепа до мягкого не почувствуете сопротивление. Одновременное падение церебрального кровотока значение в процентах (= 80%) по сравнению с исходным подтверждается лазерной допплеровской флоуметрии. 2 воротник швы затягиваются вокруг вставленной нити.
    2. Для переходных мозговой ишемии экспериментов, окклюзии шов аккуратно снята через 45 минут. На этот раз точка может быть изменена для различных экспериментальных целей.
    3. После снятия шва нитью, сайт arteriotomy закрыта, чтобы избежать послеоперационных кровотечений. В методе Коидзуми, это связано с ужесточением надежно воротник швов вокруг ОСО. В технике Лонга, в arteriotomy сайт на базе ЕЦА является обезболивающий укол, то воротник швов на проксимальной МКА являются ослабил и снял для восстановления сонной потока.
    4. Чтобы закрыть разрез, подчелюстной железы и СКМ укладывать на операционном поле. Края раны, затем приблизить ткани клей в шейном и кожи головы районов. Кроме того, рассасывающиеся основной шов или металл может быть использован, чтобы закрыть рану особенно когда долгосрочного выживания животного предназначено.
    5. После закрытия разреза, животное получает 1 мл теплой солевой подкожно, как объем пополнения. Дозы соответствующих анальгетиков (т.е. Бупренорфин на 0,05-0,1 мг / кг) следует использовать, чтобы минимизировать боль животного и дискомфорт во время восстановительного периода. Анимал удаляется из хирургического набора и помещен в теплой области восстановления / клетку, чтобы предотвратить переохлаждение, со свободным, легким доступом к мягкой пищи и воды.

    4. Послеоперационное неврологическое обследование

    После животное приходит в общее сознание, неврологического дефицита можно оценить по простой шкале (пятибалльная шкала) следующим образом 3:

    1. не наблюдается дефицита
    2. отказа продлить контрлатеральной передней лапой (легкая координационного неврологического дефицита)
    3. кружили в направлении контралатеральной на инфаркт (умеренная координационного неврологического дефицита)
    4. падения в направлении контралатеральной к инфаркта (тяжелая координационного неврологического дефицита)
    5. депрессии уровень сознания, не стихийное движение

    5. Окрашивание и количественного измерения объема мозга инфаркта

    1. После 24 часов реперфузии MCA, выживших мышей взвешивали, глубоко под наркозом с 4% isoflorane и принес в соответствии с утвержденным протоколом.
    2. Мозг осторожно удаляют и помещают в мозг мыши слайсер матрицы, и весь головной мозг является секционного коронки на 2 интервала мм.
    3. Разделы погружены в 2% ТТС в фосфатном буферном растворе (PBS) при 37 ° С в течение 20 минут. После окрашивания ТТС, infracted области отображается как белый (неокрашенных) тканей, прилегающих к красного кирпича (жизнеспособных) ткани (рис. 1).
    4. Последовательные разделы фотографируются с помощью цифровой камеры, а площадь инфаркта измеряется с программой J изображения.
    5. Области инфаркта (белые, неокрашенные), площадь ипсилатерального полушария (белый и красный кирпич, окрашенные) и области контралатерального полушария (красный кирпич, окрашенные) измеряются для каждого раздела. Объем рассчитывается путем суммирования репрезентативных районов во всех разделах и умножения на толщина среза. После исправления для купирования, объем миокарда рассчитывается по следующей формуле 9:
      Исправлено Инфаркт Объем (CIV),% = [контралатеральной объема полушария - (объем ипсилатерального полушария - инфаркт объема)] / контралатеральной полушарии объем х 100

    6. Представитель Результаты

    После окклюзии и реперфузии MCA через левую ОСО установить переходный церебральная ишемия, животных умерщвляют и их коронки секционного мозги окрашивали TTC для оценки объема инфаркта (рис. 1).

    figure-protocol-1
    Рисунок 1. TTC-окрашенных серийный корональные разделы мозга (2 мм) от мышей, подвергнутых воздействию MCA окклюзии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Модель MCAO является признанным модель, которая воспроизводит ишемии головного мозга у мышей вида. Эта модель впервые была использована в крыс, а затем адаптированных к мышам. Как избежать удаление фрагментов костей черепа, чтобы исключить влияние хирургических манипуляций на проницаемость гематоэнцефалического барьера и внутричерепное давление, является преимуществом данной методики. Однако, много переменных, таких как деформация связанных различия 10, размер шовного наконечник 11, длительность ок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никакого конфликта интересов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Тип Компания Номер в каталоге Комментарии (необязательно)
Мужской мышей C57BL / 6 Животное Харлан Laboratories, Индианаполис, Индиана, США 20-26 гр
Препарирование микроскопом Микроскоп Leica стерео микроскоп MZ6 6.3:1 зумом
Волоконно-оптический осветитель Осветитель TechniQuip Corp, Ливермор, Калифорния, США FO1-150
Изофлюрана Анестезия Бакстер Фармацевтика, Дирфилд, штат Иллинойс 1001936060
SuperCut ножницеобразный Ирис, прямая Хирургический инструмент Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США 14218
Vannas микро-ножницеобразный, прямой Хирургический инструмент Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США 14003
Дюмон штраф пинцетом кончик Хирургический инструмент Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США 503290
Судно клип Хирургический инструмент Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США 14120
Высокая частота Эксикатор 900 Хирургический инструмент Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США 500397
7-0 хирургические шовные мононити нейлон Шов Ethicon, Inc Сомервилл, Нью-Джерси, США 1647G Шовный для окклюзии
7-0 хирургических шовных Шелковый Шов Ethicon, Inc Сомервилл, Нью-Джерси, США 7733G Шовный для перевязки
Силиконовые силиконовый клей Силиконовая резина Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США 1571
Vetbond Ткань клей Компания 3M, Сент-Пол, Миннесота, США 70200746587
Puralube Vet Мазь Глазная мазь Pharmaderm, Мелвилл, штат Нью-Йорк, США
Бупренорфин hydrochlorode Анальгетики Hospira Inc, Лейк-Форест, Иллинойс, США НДЦ 0409-2012-32
Тепловая единица Прижигание Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США 501292
PeriFlux System 5000 TCD флоуметрии Perimed, Стокгольм, Швеция
BAT-12 Ректального термометра Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США BAT-12R
Т / НАСОС, TP600 Тепловые одеяла Гаймар, Нью-Йорк, США
2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида Реагент Sigma-Aldrich Ко, Сент-Луис, Миссури, США T8877
Мыши мозга матрицы слайсер Мозг слайсер Живич-Миллер Lab., Inc, Эллисон-Парк, Пенсильвания, США BSMAS001-1

Ссылки

  1. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, e21-e181 (2009).
  3. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).
  4. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  5. Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19, 641-648 (1997).
  6. Fujii, M. Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).
  7. Bederson, J. B. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).
  8. Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).
  9. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
  10. Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
  11. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
  12. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Внутрипросветный средней мозговой артерии (MCAO) Модель развития ишемического инсульта с лазерной допплеровской флоуметрии Руководство у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.