Высокая пропускная способность На месте Гибридизация метод для характеристики Шаблоны экспрессии мРНК в фетальных Мышь Нижняя урогенитального тракта

Краткое содержание

Здесь мы описываем эффективные высокой пропускной способности На месте Гибридизации (МОГ) метод визуализации моделей экспрессии мРНК в развитии плода разделы предстательной железы мыши ткани. Метод может быть легко адаптирована для визуализации моделей экспрессии мРНК в других тканях, мыши или в тканях, от других видов.

Аннотация

Развитие нижних мочевыводящих путей (НМП) представляет собой сложный процесс. Эта сложность проявляется при формировании предстательной железы из уретры мужского плода, что зависит от андрогенных сигналов и эпителиально-мезенхимальных взаимодействий^1,2. Понимание молекулярных механизмов, ответственных за развитие предстательной железы, может помочь выявить механизмы роста, которые неоправданно активируются в более позднем возрасте, приводя к таким заболеваниям, как доброкачественная гиперплазия предстательной железы и рак предстательной железы.

Развивающийся мочеполовой тракт (LUT) анатомически сложен. К моменту начала образования простатических почек на 16,5-й день после зачатия (dpc) присутствует множество типов клеток. Сосуды, нервы и гладкие мышцы располагаются в мезенхимальной строме³. Эта строма окружает многослойный эпителий и способствует формированию фетальной предстательной железы посредством паракринных сигналов, зависящих от андрогенных рецепторов⁴. Идентичность стромальных генов, отвечающих на воздействие андрогенных рецепторов и необходимых для развития предстательной железы, а также механизм формирования протокового эпителия простаты в ответ на экспрессию этих генов изучены не полностью. Способность точно идентифицировать типы клеток и локализовать экспрессию специфических факторов в них имеет решающее значение для дальнейшего понимания развития предстательной железы. Гибридизация in situ (ISH) позволяет локализовать мРНК в ткани. Таким образом, этот метод может быть использован для определения паттерна и времени экспрессии сигнальных молекул и их рецепторов, что позволит выявить потенциальные регуляторы развития предстательной железы.

В данной работе мы описываем высокопроизводительный метод гибридизации in situ (ISH) для идентификации паттернов экспрессии мРНК в LUT плода мыши с использованием срезов, полученных на вибрирующем микротоме. Этот метод обладает рядом преимуществ по сравнению с другими протоколами ISH. Проведение ISH на тонких срезах, закрепленных на предметном стекле, технически затруднительно; криосрезы часто характеризуются низким структурным качеством, а как криосрезы, так и парафиновые срезы зачастую дают слабое разрешение сигнала. Выполнение ISH на целых образцах тканей может привести к захвату зонда. Напротив, наш высокопроизводительный метод использует толстые срезы, которые позволяют детально рассмотреть архитектуру ткани. Модифицированные микроцентрифужные пробирки облегчают манипуляции со срезами в ходе процедуры ISH. Из одного LUT плода на стадии 17.5dpc можно проскринировать максимум 4 транскрипта мРНК с детектированием до 24 транскриптов мРНК за один запуск, что снижает затраты и максимально повышает эффективность. Данный метод позволяет обрабатывать несколько групп лечения идентично и как единое целое, тем самым устраняя любую предвзятость при интерпретации данных. Что наиболее важно для исследователей простаты, этот метод позволяет определить пространственную и временную локализацию транскриптов мРНК с низкой и высокой экспрессией в уретре плода мыши, из которой развивается протоковая сеть простаты.

Протокол

1. Синтез дигоксигенин-11-UTP-Маркированный Riboprobe от ПЦР, созданных с использованием шаблона

1. Для синтеза генов конкретного riboprobe, используйте Entrez Джин (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez), чтобы получить ген кДНК ссылка (RefSeq). Используйте Primer3 программы (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) ⁵ проектировать ген-специфической ПЦР праймеры против 3'-области кДНК последовательности. Рекомендуемые параметры для выбора праймеров ПЦР описаны в другом месте (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
2. Используйте MegaBLAST программы (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) ⁶ оценить специфику выбранной последовательности ДНК. Последовательность ДНК считается конкретное, когда, используя ОЖИДАТЬ порог 0,01, она не совпадает с другой последовательности в базе данных RefSeq.
3. ПЦР усиливают riboprobe шаблона. ПЦР-реакции компонентов и термоциклирования условия должны быть оптимизированы для каждого праймера множество. Типичный 50 мкл реакции содержит: 1X буфере, 2 мМ MgCl _2, 0,2 мм дНТФ, 1X Q решение, 1 мкг кДНК, 2.5U ДНК-полимеразы Taq, 0.25μm грунтовки, и нуклеазы без H ₂ O. Типичный протокол термоциклирования включает в себя начальный денатурации при 94 ° С в течение 2 мин затем 40 циклов 94 ° С в течение 30 сек, 57 ° С в течение 30 сек, 72 ° С в течение 1 мин и окончательного расширения при 72 ° С в течение 10 минут. КДНК использовали в реакции ПЦР синтезируется из мыши мочеполовой мРНК.
4. Отдельный продукт ПЦР методом электрофореза в агарозном геле, очищают с помощью набора Гель Добыча, и количественно очищенные продукты спектрофотометрии. Ожидаемая доходность составляет 1,2 - 3.6μg.
5. Расшифруйте ПЦР продукта в меченых riboprobe. Транскрипции реакции (40 мкл) содержит: 400ng очищенный продукт ПЦР, 1X нуклеотидные смеси маркировки содержащих дигоксигенин 11-UTP, 1X транскрипции буфера, 5U РНКазы ингибитора 80У Т7 РНК-полимеразы, и нуклеазы без H ₂ O. Инкубируйте 3-4 ч при 37 ° С и агитировать образцы каждые 30 минут.
6. Используйте Qiagen RNEASY Мини набор для очистки riboprobes на основе инструкции по очистке РНК с по-колонки пищеварения ДНКазы. Riboprobes количественно спектрофотометрически. Ожидаемая доходность 4-20 мкг. Оценка качества зонд, разделяя аликвоты с помощью электрофореза на 1,5%, без денатурирующих агарозном геле. Высокое качество зондов мигрируют в качестве отдельных полос с минимальными смазыванию.
7. Для обеспечения riboprobe в частности, признается своей цели, включают положительную ткани управления для первых ISH эксперимента. Целевой мРНК riboprobe это изображение должно быть известно в этом позитивном ткани контроля.

2. Подготовка вибрационный Клинок Микротом (на основе ранее описанного протокола) ⁷

1. Подготовка 4% легкоплавкой агарозы решение в фосфатным буферным раствором (PBS). Микроволновая решение о роспуске агарозы и поддерживать решения на 62 ° C.
2. Подготовка форм полистирола кольца путем удаления мембраны из пластин диаметром 12 мм культуры Millicell также вставки и сохранить полистирола кольцо для использования в качестве формы агарозы. Замочите кольца на ночь в раствор ингибитора РНКазы перед каждым использованием.
3. Чтобы обеспечить гладкую поверхность резки, удаления ржавчины ингибитора и другие добавки с поверхности лезвия Wilkinson промыванием следующих растворителей, при 100%-ной концентрации: петролейный эфир, ксилола, хлороформа, метанола и MilliQ воды. Отдельные двойным лезвием вдоль на две отдельные лопасти.
4. Придерживайтесь Уилкинсон лезвия микротома лезвие с Loctite клей. Микротома лезвие не используется для резки; он добавляет жесткость лезвия Wilkinson. Микротома лезвия должны быть сокращены к длине лезвия Wilkinson с использованием металлических ножниц и, как только придерживался, должны быть компенсированы 3 - 4 мм от передний край лопасти Уилкинсон.

3. Вскрытие, хранение и подготовка Урогенитальные Ткани для Секционирование

1. Подготовка PBSTw раствор (PBS, содержащего 0,1% Твин ™ 20 и 0,2 мм азид натрия, фильтруют через 0.22μm Stericup ® фильтр). Решение может быть подготовлен заранее и хранить при температуре 25 ° C.
2. Инкубируйте недавно расчлененный мыши LUT (мочевой пузырь, мочеиспускательный канал тазовых и связанные с ними Вольфианская и Mϋllerian протока-производных структур) в течение ночи при температуре 4 ° С в PBS, содержащий 4% параформальдегида фиксатором.
3. Дегидрировать тканей промывкой в ​​течение 10 минут при 25 ° С в серии градуированных метанол / PBSTw (1:3, 1:1, 3:1 об / об) решений. Магазин образцы при -20 ° С на 100% метанола по крайней мере за одну ночь. Архив ткани могут быть по крайней мере 2yr.
4. Подготовка тканей для секционирования по станавливающим архив тканей. Промыть в течение 10 минут при 25 ° С в серии градуированных метанол / PBSTw (3:1, 1:1, 1:3 об / об) решений.
5. Препарировать и отказаться примерно две трети из мочевого пузыря, в результате чего большинство из треугольника части и крепятся к уретре.

<р = класс "jove_title"> 4. Вложение Урогенитальные тканей в агарозном

1. Место плесень полистирола кольца, плоские поверхности вниз на 25 ° C ясно микроскопический слайд стекла.
2. Заполните форму кольца с 62 ° C агарозном решения и остыть в течение 2 мин.
3. Удалить LUT ткани PBSTw и насухо промокните на абсорбирующей салфеткой.
4. Передача ткани в раствор агарозы.
5. Используйте пинцет, чтобы ориентировать LUT ткани в агарозном так, чтобы она подвешена на полпути между верхней и нижней частях кольца плесени и инкубировать ткани при температуре 4 ° С до агарозном укрепил.
6. Если ткань раковины полностью в процессе затвердевания агарозы, он может быть исключен из агарозы и повторно внедрены. Отрегулируйте время охлаждения агарозы по мере необходимости во время повторного вложения процесса.

5. Секционирование Урогенитальные ткани с вибрационный Микротом (на основе ранее описанного протокола) ⁷

1. Горы усиленные лезвия Wilkinson в вибрирующих микротома и установить лезвие угол до 35 °. Заполните ванну люкс образца с PBS и упаковать мокрого льда вокруг образца ванну.
2. Удаление затвердевшей агарозы вилку из кольца плесень и пятна с поверхности дна абсорбирующие салфетки. Убедитесь, что ткань ориентирована правильно. Ткани ориентации могут быть скорректированы с помощью лезвия бритвы, чтобы скос плоского края плагин агарозы.
3. Придерживайтесь плагин агарозы на вибрирующих микротома образца установки диска с Loctite клей, как показано на рис. 1А.
4. Вставьте образец установки диска в vibratome.
5. Отрегулируйте микротома толщиной 50 мкм раздел, скорость до 2, а амплитуда лезвия до 4 и начните вырезать срезах тканей.
6. Используйте тупой пинцет для передачи каждой ткани сечения (рис. 1В) до 24-и культуре пластины хорошо, что содержит ледяной 0,5 мл PBSTw.
7. Для подготовки образцов для гибридизации на месте, акцизов большинство из агарозы вокруг каждого срез ткани (остальные агарозном будет таять во время процедуры ISH) и удалить все связанные с мусором. Магазин сечением до 48 ч при 4 ° С в PBSTw.

6. Пример корзины Подготовка к В гибридизация

1. Отрежьте нижнюю часть микроцентрифужных трубки на 100 мкл марки.
2. Тепло сократить край трубки в пламени, пока пластик размягчается, а затем нажмите микроцентрифужных трубки твердо на центр 0,5 дюйма квадратными ячейками полиэстера.
3. Обрезать избыток сеткой и использовать подогревом 18 иглу, чтобы проколоть два отверстия в каждую пробирку крышкой для завершения подготовки корзине (рис. 1в).
4. Снимите крышку 24 лунками и сверлить отверстия 12 мм с центром над каждую лунку. Используйте крышку для передачи образцов корзины между моет протокола ISH (рис. 1D).

7. Эмбрион Порошок Подготовка к В гибридизация (на основе ранее описанного протокола) ⁸

1. Сбор ткани эмбриона мыши от мышей, которые являются одной сцене как срезах тканей, которые оцениваются и хранить при температуре -80 ° C. Место замороженной ткани в керамический строительный раствор, погрузите ткани в жидком азоте, а также использовать пестик для измельчения ткани в мелкий порошок.
2. Комбинат эмбриона порошок с 4-х томах ацетона и гомогенизации с несколькими ударами гомогенизатор Dounce.
3. Передача гомогената на 15 мл стеклянный завинчивающейся флакон и извлекать на ночь при 4 ° C.
4. Гранул эмбриона порошка путем центрифугирования при 5000rpm в течение 10 минут при 4 ° C. Удаляют содержащих липиды супернатант. Ресуспендируют ткани пеллет в 4vol свежего ацетона и экстракт для 2ч при температуре 4 ° C.
5. Гранул эмбриона порошка путем центрифугирования при 5000rpm в течение 10 минут при 4 ° C. Удаляют супернатант.
6. Воздух сухой осадок на # 2 Whatman фильтровальной бумаги. Давка гранул для получения мелкого порошка и хранить в плотно закрытых стеклянных флакона при 4 ° C. Приблизительную мощность составляет 50 мг порошка на 1 г сырого веса эмбриона.

8. Ситу В День Гибридизация 1

1. Разогреть prehybridization решение (50% формамида, 5x SSC, 1% Блокировка реагента, 10μg/mL дрожжевой тРНК, гепарин 10μg/mL хранить при -20 ° C) до 60,5 ° C. Это решение может быть подготовлен заранее и хранить при температуре -20 ° C.
2. Подготовка влажной камере гибридизации, заполнив небольшую пластиковый контейнер хранения с примерно 0,5 в водопроводной воде. Крышка контейнера и подогреть до 60,5 ° C.
3. Добавить 2 мл PBSTw для скважин из 24-и культуру пластину. Место образец корзины в отверстия 24-а крышку пластины и секции передачи ткани в корзинах (до 10 секций в корзине были использованы).
4. Инкубируйте срезов ткани в течение 30 минут при 25 ° С в 6% H ₂ O _2. Этот и все последующие инкубации должно осуществляться с нежным агитации на орбитальный шейкер, если не указано иное. Все инкубацииг моет проводятся в 24-луночных планшетах и ​​использование общего объема решение 2mL/well.
5. Вымойте срезах тканей 4 х 5 мин при 25 ° С в PBSTw.
6. Инкубируйте срезах тканей для 12 мин при 25 ° С в PBSTw содержащие 5μg/mL протеиназы К.
7. Вымойте срезах тканей 1 х 5 мин при 25 ° С в PBSTw.
8. После исправления срезах тканей для 20 минут при 25 ° С в PBS, содержащий 4% параформальдегида и 0,2% глутарового альдегида.
9. Вымойте срезов ткани 2 х 5 мин при 25 ° С в PBSTw.
10. Добавить 2mL/well из нагретого буфера prehybridization и инкубировать срезах тканей внутри влажной камере гибридизации, по крайней мере 1 час при 60,5 ° C.
11. Добавить 0.65μg помечены riboprobe к prehybridization буфера в каждую лунку и инкубировать срезов ткани на ночь в увлажненной камере гибридизации на 60,5 ° C.

9. Ситу В День Гибридизация 2

1. Подготовьте следующие решения для пост-гибридизации шаги моющие: Решение 1 (50% формамида, 5x SSC, 1% SDS), Решение 2 (10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 0,5 М NaCl, 0,1% Твин ™ 20, 0,2 мм азид натрия , 0.22μm фильтруется), и решение 3 (2x SSC, 50% формамид). Эти решения могут быть подготовлены заранее. Решения 1 и 3 хранятся при температуре -20 ° С и Решение 2 хранится при температуре 25 ° C. Срок хранения решения составляет не менее 3 месяцев.
2. Вымойте срезах тканей 3 х 30 минут на 60,5 ° С, подогретого Решение 1. Использование влажной камере во время мытья.
3. Вымойте срезах тканей 1 X 10мин на 60,5 ° С, подогретого Решение 1/Solution 2 (1:1 об / об) решение. Использование влажной камере во время стирки.
4. Вымойте срезах тканей 4 х 10 мин при 25 ° С, Решение 2.
5. Инкубируйте тканей разделы для 15 мин при 37 ° С в растворе 2, содержащих 0.25μg/mL РНКазы.
6. Вымойте срезах тканей 1 X 10 мин при 25 ° С с раствором 2 (без РНКазы).
7. Вымойте срезах тканей 1 X 10 мин при 25 ° С с раствором 3, затем 2 X1hr моет на 60,5 ° С, Решение 3. Использование влажной камере при 60,5 ° C моет.
8. Подготовьте следующие решения для иммуногистохимического выявления DIG-меченых riboprobes: ткани блокирующего буфера (туберкулез, 1X TBS, 10% овец сыворотки, 1% блокирующий реагент, 1% БСА, 0,1% Твин ™ 20, 0.22μm фильтруется), Антитела Разбавление Буфер (AD, 1xTBS, 5% овечьей сыворотки, 1% блокирующий реагент, 1% БСА, 0,1% Твин ™ 20, 0,2 мм азид натрия, 0,22 м ™ фильтруется) Антитела Поглощение буфера (AA, 1xTBS, 5% овечьей сыворотки, 1 % блокирующий реагент, 1% BSA, 6mg/mL порошок эмбриона) и TBSTw (1xTBS, 0,1% Твин ™ 20, 0,2 мм азид натрия, 0.22μm фильтруется). Эти решения могут быть подготовлены заранее. TBSTw хранится при температуре 25 ° C, то все другие решения, хранятся при температуре -20 ° C.
9. Вымойте 3 х 10 мин при 25 ° С TBSTw.
10. Инкубируйте срезах тканей крайней мере 2ч при 25 ° С в борьбе с туберкулезом буфера.
11. Хотя тканей вынашиваются в ТБ буфера, добавить 1.1μL анти-DIG антител в буфере 200 мкл AA для каждой скважины. Инкубируйте А. А. буфера + антитела не менее 2ч при температуре 4 ° С, то центрифуге при 10 000 оборотов в минуту в течение 1 мин. Удалить супернатант А. А. буфера и добавить его в 2 мл AD буфера.
12. Удалить срезов ткани от туберкулеза буфера и инкубировать их в течение ночи в увлажненной камере при температуре 4 ° С в AD буфер, содержащий антитела.

10. В Ситу День Гибридизация 3

1. Подготовка цвета решение для разработки NTMT (100 мм Трис-HCL рН 9,5, 100 мМ NaCl, 50 мМ MgCl _2, 0,2 мм азид натрия, 0.22μm фильтруется). Это решение может быть подготовлен заранее и хранить при температуре 25 ° C. Непосредственно перед применением, добавьте 2 мМ левамизол и 0,1% Твин ™ 20.
2. Удалить раствор антител (AD буфера + антитела) из скважин и хранить раствор при 4 ° C. Он может быть использован повторно до еще два раза.
3. Вымойте тканей 8 х 10 мин при 25 ° С TBSTw содержащей 2 мМ левамизол.
4. Тщательно передачи ткани от корзины чашке Петри содержащие TBSTw. Используйте пинцет, чтобы удалить видимые мусора. Передача тканей в чистые трубы микроцентрифужных.
5. Вымойте тканей 1 X 10 мин при 25 ° С NTMT 1 мл.
6. Удалить NTMT и добавить 1mL/tube смеси, содержащей 50% NTMT (содержащий 2 мМ левамизол) и 50% BM Purple, трубы в месте, защищенном от света окна и инкубировать при температуре 25 ° C. Цвет времени развития колеблется от нескольких часов до нескольких дней. Если цвет развивается медленно, 100% BM Фиолетовый могут быть использованы.
7. Монитор развития и изменения цвета NTMT / BM Фиолетовый решение, если он накапливается осажденные кристаллы или если она подвергается изменению цвета с желтого до фиолетового. После полного развития цвета (4-250 часов), стирать ткани 2 х 5 мин при 25 ° С с 1mL/tube из NTMT содержащей 2 мМ левамизол.
8. Инкубируйте тканей течение ночи при 4 ° С в 1mL/tube ФСБ, содержащий 4% параформальдегида пост-фиксатором.
9. Для отбеливания тканей, тканей инкубировать в течение 30 минут при 25 ° С в 1mL/tube из PBSTw, содержащий 3% H ₂ O ₂
10. Ткань разделы монтируются на стеклах, coverslipped, а полученную с использованием сложного микроскопа.

11. Представитель Результаты:

Пространственной ориентации LUT ткани в агарозном определяет плоскость срезах тканей. Для сагиттальной разделов, по крайней мере две трети пузырь вырезали, а оставшиеся LUT ткани вложен в агар, что уретры средней линии параллельно плоской поверхности плагин агарозы (рис. 1А). Незначительные изменения в тканях плоскости могут быть сделаны фаски плоских края плагин агарозы. Представитель сагиттальной участке от 17.5dpc мужской ткани LUT, которая ориентирована в этой плоскости показано на рисунке 1b.

Пример корзины защитить тонкие тканевые срезы от потери и от накопления пыли и твердых частиц во время многодневных ISH процедуры. Пример корзины готовятся плавления полиэфирной сетки, чтобы обрезанный конец трубки микроцентрифужную 1,5 мл (рис. 1в). Маленькое отверстие прокалывается в крышку каждого образца корзине облегчить решение поток в страну и из корзины. Пример корзины взвешены в ISH решения, помещая их в просверленные отверстия 12 мм в 24-луночный планшет крышкой (рис. 1D). Изменение крышки пластины поддержки корзины, когда они передаются между 24-луночных планшетах в течение раствора изменяется.

Задача сложная, ограничить неспецифические фоне окрашивание в течение длительного периода инкубации, необходимые для обнаружения низких мРНК изобилие. Добавлением 0,2 азид натрия в образце буферов и их последующей фильтрации через 0.22μm фильтры появились ограничить фоне окрашивания (рис. 2). Использование метода, описанного здесь, там, кажется, не видны различия в окраске фона, когда образцы инкубируют в цвете разработки решений для длительных периодов времени (рис. 3).

Рисунок 1. Подготовка мыши ниже мочеполовой (LUT) тракта срез ткани и микроцентрифужных трубки корзина для ISH. LUT содержащее часть мочевого пузыря, уретры и тазового связанные Вольфианская и Mϋllerian протока полученные структуры) вложена в цилиндрический разъем на 4% легкоплавкой агарозы. (А) вилка приклеены к образца установки диска и (Б) разрезать на 50 мкм секций с вибрирующим микротоме. (C) LUT разделе переносится в корзину микроцентрифужных трубка, которая готовит пирсинг отверстие в крышке трубы и сетка слияния полиэстера до конца вырезать нижнюю часть трубки. (D) микроцентрифужных трубка вставляется в 12 мм отверстия, просверленные в 24-луночный планшет крышкой, так что срезах тканей взвешены в буферный раствор в течение ISH протокола. Стрелки указывают LUT ткани в пробке агарозы.

Рисунок 2. Включение 0,2 азид натрия в 0.22μm фильтруется решения улучшает качество тканей и уменьшает фоновый окрашивания. 17.5dpc самца мыши нижних мочеполовых путей (LUT) были секционного в сагиттальной плоскости с толщиной 50 мкм. Ткань Срезы окрашивали по ISH с помощью зонда направлена ​​против поворот гомолога 1. Буферов, используемых для ISH были либо (А) 0.22μm фильтруется и дополнена 0,2 азид натрия (NaAz) или (В) не фильтруются и не дополнены NaAz. Стрелки указывают на фоне пятен. Изображения были захвачены в то же увеличением. Результаты представитель окрашивания образцов для п = 3 помета независимые мышей.

Рисунок 3. Фон интенсивности окрашивания, кажется, не увеличивается с длительным развитием цвета. 17.5dpc самца мыши нижних мочеполовых путей (LUT) были секционного в сагиттальной плоскости с толщиной 50 мкм. Срезы окрашивали ISH путем инкубации их в растворе для окрашивания хромоген () 9.5h с помощью зонда, который признает высокую стенограмму изобилие эстрогена связанных гамма рецептор (Esrrg), (B) для 43.5h с помощью зонда, который признает среду изобилия Стенограмма bromodomain прилегающих к цинка домена пальцем, 2А (Baz2a), или (С) в течение 236h с помощью зонда, который признает низкой численности стенограмму бескрылые типа MMTV интеграции сайт семьи, член 10а (Wnt10a). Изображения были захвачены в то же увеличением. Результаты представитель окрашивания образцов для п = 3 помета независимые мышей.

Обсуждение

Использование метода, описанного здесь, можно обнаружить мРНК во всех основных типов клеток и тканей отсеков плода мужского и женского мыши ТМП в том числе мезенхимальных колодки, уротелия, гладких мышц, предстательной железы почки, семяизвергательного канала и влагалища. 50 мкм разделы, используемые в настоящем протоколе имеют то преимущество, что достаточно толстой, чтобы решать ткани архитектуры (таких как кровеносные сосуды), но достаточно тонкие, чтобы избежать захвата зонда, который является методологическая пробл...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Анти-дигоксигенин антитела, Fab фрагментов	Roche Applied Science	11214667001
Блокировка реагента	Roche Applied Science	11096176001
Б. М. Фиолетовый AP подложки, осаждая	Roche Applied Science	11442074001
Бычьего сывороточного альбумина	Fisher Scientific	BP1600-100
Клеточные культуры пластины, 24 а	Гранулирование	3524
Дигоксигенин 11-UTP	Roche Applied Science	1277073910
дНТФ	Roche Applied Science	11969064001
Обоюдоострым лезвием бритвы	Wilkinson Sword	Классические модели
Eliminase РНКазы для удаления	Decon лаборатории	1102
Формамид	Сигма	F5786-1L
Гель добычи комплект	Qiagen	28704
Глутаральдегид, 25% раствор в H 2 O	Сигма	G6257-100мл
Гепарин, натриевая соль	Сигма	H3393
Перекись водорода, 30% раствор в H 2 O	Fisher Scientific	BP2633-500
Левамизол	Сигма	L9756
Loctite 404 Клей быстрого мгновенного набора	Корпорация Henkel	46551
Хлорид магния	Fisher Scientific	M33-500
Малеиновая кислота	Сигма	M0375-500G
Микроцентрифуга труб, 1,5 мл	Biologix Исследовательская компания	BP337-100
Millicell культуры пластины вставки	Millipore	PICM01250
Молекулярная шлифовальные смолы	G-биологических наук	786-138PR
Параформальдегид, 4%-ного раствора в фосфатном буферном растворе	Affymetrix	19943
Фосфатным буферным раствором, без Са и Mg	Депутат Biomedicals	ICN1760420
Полиэфирная сетка, 33 мкм, 12 "х 24"	Мелкие детали Inc	CMY-0033-D
Протеиназы К решению, 20mg/ml	Amresco	E195-5мл
QIAshredder Столбцы	Qiagen	79654
Q решение	Qiagen	Поставляется с Taq-ДНК-полимеразы
РНКазы	Сигма	R6513
РНКазы ингибитор	Roche Applied Science	03335399001
RNeasy мини-комплект	Qiagen	74104
RNEASY мини-комплект	Qiagen	74104
RQ1 РНКазы без ДНКазы	Promega	M6101
Легкоплавкий легкоплавкой агарозы	Lonza	50101
Овцы сыворотке	Сигма	S2263-500 мл
Stericup фильтр, 0.22μm, полиэфирсульфона, 500 мл	Millipore	SCGPU05RE
Азид натрия, гранулированный	Fisher Scientific	S227I-100
Хлористый натрий	Fisher Scientific	BP358-212
Додецилсульфата натрия	Fisher Scientific	S529-500
SSC, 20X решение	Исследования Products International	S24022-4000,0
Надстрочный III первого прядь синтеза системы	Invitrogen	18080-051
Т7 РНК-полимеразы	Roche Applied Science	10881767001
Taq-ДНК-полимеразы	Qiagen	201203
Трис-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Твин-20	Fisher Scientific	BP337-100
Вибрационный микротома с ванной образца люкс	Leica Microsystems	VT1000A
Дрожжи тРНК	Roche Applied Science	109495