Изменение 3-D в пробирке система представлена в которых рост характеристики нескольких опухолевых клеточных линий в разведенной базальной мембраны коррелирует с спящих или пролиферативного поведения опухолевых клеток при метастатической вторичный узел В естественных условиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
In Vitro Система по изучению опухолей покоя и Переключить на рост метастазов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Рецидив рака молочной железы часто происходит после длительного латентного периода, в течение которого признаки рака отсутствуют, а метастазы могут не проявляться клинически в течение многих лет после удаления первичной опухоли и проведения адъювантной терапии. Вероятным объяснением этого явления является то, что опухолевые клетки заселяют метастатические очаги, обладают устойчивостью к традиционным методам терапии и остаются в состоянии покоя в течение длительного времени 1-4.
Ранее существование спящих раковых клеток в вторичных очагах описывалось как состояние покоя одиночных клеток, которые не пролиферируют и не подвергаются апоптозу 5-7. Более того, было показано, что эти одиночные клетки диссеминируют из первичной опухоли на ранней стадии прогрессирования заболевания 8-10 и находятся в состоянии остановки роста в костном мозге, крови и лимфатических узлах пациентов 1,4,11. Таким образом, понимание механизмов, регулирующих состояние покоя или переход в пролиферативное состояние, имеет решающее значение для поиска новых мишеней и методов вмешательства с целью предотвращения рецидива заболевания. Однако выяснение механизмов, регулирующих переход от покоя опухоли к метастатическому росту, было затруднено отсутствием доступных модельных систем.
in vivo и ex vivo модельные системы для изучения метастатического прогрессирования опухолевых клеток были описаны ранее 1,12-14. Однако эти модельные системы не позволили в режиме реального времени и с высокой пропускной способностью получить механистическое понимание того, что именно инициирует переход одиночных спящих опухолевых клеток к пролиферации, приводящей к метастатическому заболеванию. Недавно мы разработали трехмерную (3D) систему in vitro для моделирования характеристик роста in vivo клеток, которые проявляют либо спящее (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46), либо пролиферативное (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) метастатическое поведение in vivo. Мы продемонстрировали, что опухолевые клетки, проявляющие состояние покоя in vivo в месте метастазирования, остаются квиесцентными при культивировании в трехмерном (3D) экстракте базальной мембраны (BME), тогда как клетки с высокой метастатической активностью in vivo легко пролиферируют в 3D-культуре после различных, но относительно коротких периодов квиесценции. Важно отметить, что, используя модельную систему 3D in vitro, мы впервые показали, что состав внеклеточного матрикса (ECM) играет важную роль в регуляции перехода спящих опухолевых клеток в пролиферативное состояние, и подтвердили это в исследованиях in vivo15-17. Таким образом, модельная система, описанная в данном отчете, представляет собой метод in vitro для моделирования дормантности опухоли и изучения перехода к пролиферативному росту, индуцированного микроокружением.
Протокол
1. Клеточные культуры поддержание покоя и метастатических опухолевых клеточных линий
- Расти неактивные (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) и метастатических опухолевых клеток (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) в 10 см культуры чашки, содержащие Средний Дульбеко изменения Орла (DMEM) высокий уровень глюкозы и 10% эмбриональной телячьей сыворотки ( FBS) и антибиотики. Как только клетки достигают 70-80% слияния, переходите к следующей анализов.
2. Пролиферации клеток анализа покоящихся (в состоянии покоя) и метастатические (пролиферирующих) опухолевые клетки культивировали в 3D-BME системы
Культивирование спящие / метастатических клеток в 3D-системе
- Оттепель Cultrex фактор роста снижение базальной мембраны экстракт (BME) в 4 ° C холодильнике ночь перед проведением анализа. Обратите внимание, BME должны решаться на льду во все времена.
- На следующий день, место 96 ячейках на подносе льда внутри ламинарного капотом. Пальто каждую лунку с 50-100 мкл ледяной BME использовании дозатора с помощью шприца. Убедитесь в отсутствии пузырьков образуются в скважинах. Место 96-луночного планшета покрыта BME в увлажненной инкубаторе с 5% CO 2 при 37 ° С в течение 30 минут.
- В то же время аспирации средств массовой информации из спящих и или метастатическим опухолевым клеткам (подготовлен в разделе 1). Промыть культуры пластин с 10 мл физраствора с фосфатным буфером, рН 7,4 (PBS). Аспирируйте PBS и добавьте 2 мл трипсина предварительно нагревают при 37 ° С, к культуре пластин. Инкубируйте пластин в увлажненной 5% CO 2 при 37 ° С, в течение 5 мин.
- Передача клетки 15 мл коническую трубку с 5 мл DMEM высокий уровень глюкозы с добавлением 10% FCS и антибиотиков и подсчет клеток.
- Спином вниз общего числа клеток, чтобы быть культурными в центрифуге культуры ткани со скоростью 1500 г, при комнатной температуре в течение 5 мин. В наших тестах мы готовим 2-10 3 клеток / лунку для каждой клеточной линии или момент времени на обследование. Однако, это может варьироваться в зависимости от клеточных линий используются.
- Тщательно аспирата супернатант. Обратите внимание, что в большинстве случаев гранулы не видно. Таким образом, оставить некоторые СМИ позади. Нажмите внизу 15мл коническую трубку пальцами, чтобы приостановление отдельных клеток получается. Повторное приостановить гранул с DMEM низкий уровень глюкозы с помощью антибиотиков с добавлением 2% FCS + 2% BME (анализ СМИ). 100 мкл анализа СМИ должны быть добавлены для каждого 2x10 3 клетки. Измельченного в порошок клетках много раз с 5 мл пипетки, чтобы суспензии отдельных клеток сохраняется.
- Пластина 100 мкл Смесь клеток на лунку в верхней части 96-BME покрытием пластины. Для оценки фона (в разделе 2.8) знаке, помимо 100 мкл на лунку только анализ средств массовой информации на вершине 96-BME покрытием пластины. Инкубируйте культурный 96-луночных в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C. Клетки должны быть повторно подается каждые 4 дня с анализа СМИ.
Распространение анализа:
- Распространение анализа клеток: добавить в скважинах в заданное время точках 20 мкл сотовый Титр 96 Водные одно решение сотовый комплект анализа распространения. Инкубируйте в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 2 часов. Использование чтения ИФА записи абсорбции при 490nm. Для оценки фона и вычитание, добавить 20 мкл сотовый Титр 96 Водные одно решение сотовый комплект анализа распространения в лунки предварительно покрытых BME и только обложил анализа СМИ. Использование чтения ИФА рекорд оптической плотности при 490 нм.
3. Иммунофлуоресцентного окрашивания для сотовых сигнальных молекул в латентной (в состоянии покоя) опухолевых клеток и / или метастатическим (пролиферирующих) опухолевых клеток
Культивирование спящие / метастатических клеток в 3D-система для окрашивания immunfluorescence
* Следующий протокол является модификацией 3D протокол культуры опубликованные Debnath J и др. 18.
- Подготовка BME, как описано в разделе 2.1. На следующий день: место 8-камера стекло системы на подносе льда внутри ламинарного капотом. Пальто каждую лунку с 50ul ледяной BME использовании 200 мкл pipetman. Убедитесь в том, BME распространяется равномерно и без пузырьков образуются в скважинах. Место 8 камеры стекло с покрытием BME в увлажненной 5% CO 2 при 37 ° С в течение 20 мин.
- Урожай покоя и метастатических клеток или из раздела 1 и подготовиться к культуре, как описано в разделе 2.3-2.4. Сбор общее количество ячеек, которые будут культивироваться в 15 мл коническую трубку. Мы готовим 5 х10 3 клеток / лунку для каждой клеточной линии и момент времени для анализа. Спином вниз клеток в культуре ткани центрифуги со скоростью 1500 г, при комнатной температуре в течение 5 мин. Аспирируйте supernate тщательно. Обратите внимание, что шарик не видно, поэтому оставить некоторые СМИ позади. Нажмите внизу 15мл коническую трубку пальцами, чтобы суспензии отдельных клеток получается.Повторное приостановить гранул с анализа СМИ. 400μl из анализа СМИ должны быть добавлены для каждого 5x10 3 клетки. Измельченного в порошок клетках много раз с 5 мл пипетки. Этот шаг очень важно обеспечить, чтобы суспензии отдельных клеток сохраняется.
- Пластина 400μl ячейки смеси в каждую лунку на вершине каждого из 8 камер покрыты BME. Инкубируйте культурный 8 камер стекло системы в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C. Клетки должны быть повторно подается каждые 4 дня с анализа СМИ.
Иммунофлуоресценции окрашивания:
- В нужном моменты времени, аспирация верхний слой медиа и добавьте 200 мкл фиксатором, содержащий 4% Параформальдегид (PFA), 5% сахарозы и 0,1% Тритон Х-100 и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут. Аспирируйте фиксатором и добавить 200 мкл 4% PFA, содержащий 5% сахарозы и инкубировать при комнатной температуре в течение 25 минут.
- Аспирируйте фиксатором, добавить 400 мкл фосфатно-солевым буфером (PBS) в каждую лунку. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирируйте PBS и добавьте 400 μ PBS, содержащем 0,05% Твин-20 в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Блок фиксированных клетках при комнатной температуре с 200 мкл или 10% осла сыворотки или с 3% BSA в 1 час (блокирование решения, которое будет использоваться, должны быть определены эмпирически для каждого первичного антитела).
- Аспирируйте блокирующий раствор и добавляют 200 мкл первичных антител (разведение определяется эмпирически для каждого первичного антитела, которые будут использоваться). Развести первичных антител в 10% сыворотки осла, если 10% сыворотки осла была использована для блокирования или разбавленный первичных антител в 3% BSA, если 3% BSA блокирующий раствор был использован. Инкубируйте с первичным антителом течение ночи при 4 ° C.
- Аспирируйте антител, мыть скважин с 400μl PBS в течение 15 минут и повторите дважды. Аспирируйте PBS и добавьте 200 мкл осла против соответствующего-IgG конъюгированных с родамин красный (разведение определяется эмпирически), крышка камеры 8 слайд с алюминиевой фольгой и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Вымойте скважин с 400μl PBS (3x15 минут каждого мытья). Аспирируйте PBS. Крепится VECTASHIELD монтажа среде с DAPI. Сухой слайды в течение 40 минут при комнатной температуре в темноте. Слайды могут храниться в течение 1 недели при температуре 4 ° C. Хранить слайды в темноте. Изображение слайды с помощью конфокальной микроскопии.
4. Представитель Результаты:
Примером распространения анализ спящие D2.0R и метастатических опухолевых клеток D2A1 в 3D культура показана на рисунке 1А. D2.0R клетки находятся в состоянии покоя (в состоянии покоя) в течение всего экспериментального периода 14 день, в то время как культура высокой метастатической D2A1 спящие клетки остаются только в течение четырех-шести дней, после чего они начинают размножаться. Во время начальной фазы спящие, многие клетки остаются одиночные, на 3-D культуре (рис. 1Б; 4-й день), тогда как другие не пролиферирующие клетки образуются многоклеточные сфероидов. Переход D2A1 клетками спящих на пролиферативные состояния в 3-D культуре (рис. 1В, день 12) связано с драматическим изменениям в морфологии клеток. Таким образом, этот анализ может быть использован для тестирования какой фактор / с может спровоцировать спящие клетки D2.0R выйти из их состоянии покоя и то, что фактор / с может предотвратить D2A1 клетки к переходу от их состояния покоя. Рисунок 2 является примером агента предотвращение D2A1 клетки к переходу из покоящихся на пролиферативные состояния. Как показано на рисунке 2, лечения D2A1 клетки специфического ингибитора легких цепей миозина киназы (ML-7) поддерживать D2A1 клетки в состоянии покоя.
Сотовые сигнализации в состоянии покоя и пролиферирующие опухолевые клетки культивировали в 3D-системе могут быть изучены с помощью иммунофлуоресценции окрашивания для сотовых сигнальных молекул. Как показано на рисунке 3 значительному увеличению фосфорилирования миозина легкой цепи в D2A1 клеток (красное окрашивание) с последующей реорганизацией F-актиновых филаментов актина формирования стресс волокон (зеленая окраска) происходит во время их перехода из состояния покоя (1-4 дней) Распространение (день 7). Тем не менее, блокирование легких цепей миозина активности киназы в клетках D2A1 shRNA или конкретного препарата (ML-7) сохраняет D2A1 клетки в состоянии покоя и в результате ингибирования фосфорилирования миозина свет цепи и F-актин стресс волокна организации (рис. 4).
Рисунок 1. В пробирке модель для изучения одиночной покоя опухолевых клеток и переход к метастазирования. ) Распространение спящие D2.0R и метастатического D2A1 в 3-D Cultrex BME, п = 8 (среднее ± SE). Представитель результаты трех экспериментов (* р ≤ 0,05). Б) Свет изображений микроскопии D2.0R и D2A1 клетки культивировали в 3-D x20 Cultrex BME увеличения.Рис редактировался Баркан и др. 17.
Рисунок 2. Предотвращение выключатель D2A1 клетки из состояния покоя (покоя) для распространения в 3D-системе культуры путем ингибирования легких цепей миозина киназы (MLCK). Время хода D2A1 пролиферации клеток культивировали в 3-D Cultrex BME, п = 8 (среднее ± SE). Клетки необработанных (контроль), или обработать специфический ингибитор MLCK (ML-7, 5 мкМ) в течение 48 часов начиная с 5-й день культуры. Рис редактировался Баркан и др. 17.
Рисунок 3. Миозин света фосфорилирования цепи следует F-актин реорганизации во время переключения из D2A1 клетки из состояния покоя и пролиферативной роста. D2A1 клетки культивировали в 3-D Cultrex BME на 8 предметное стекло камеры. Клетки фиксировали и окрашивали DAPI (синий) для ядерной локализации, фаллоидином (зеленый) для F-актин и с антителами против фосфорилированных форме легких цепей миозина (MLC-р) (красный), как указано в различные моменты времени. Слияние F-актин, а MLC-р окрашивания (желтый). Выражение MLC-р была увеличена при переходе D2A1 клетки из состояния покоя (days1-4) для пролиферативной роста (7-й день) с последующим актина стресс формования волокна (стрелки). Конфокальной микроскопии, увеличение x63. Белый бар равен 20 микрон. Рис редактировался Баркан и др. 17.
Рисунок 4. . Ингибирование легких цепей миозина киназы (MLCK) опосредованы F-актин стресс волокна образования в D2A1 клетки D2A1 Клетки необработанных (контроль), или лечение с ингибитором для MLCK (ML-7, 5 мкМ), в течение 48 часов начиная с культурой день 5, или лечение с яичницей или MLCK shRNA и витражей для фосфорилированных форме легких цепей миозина (MLC-р) (красный), F-актин (зеленый), и ядра (синий). Слияние F-актин, а MLC-р окрашивания (желтый). Конфокальной микроскопии, увеличение x63. Белый бар равен 20 микрон.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Основные механизмы, которые поддерживают распространяются опухолевые клетки в состоянии покоя или привести к их переходу к метастатического роста остаются малоизвестными. Это явление было чрезвычайно трудно учиться в человеческих пациентов 4,12 и несколько доклинических моделях были разработаны для решения этого вопроса. Тем не менее, некоторые в естественных условиях и экс-естественных условиях модельных систем для опухоли покоя были охарактеризованы (обзор в 1,12). Тем не менее,...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при частичной поддержке Внутренние программы исследований Национального института рака.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| DMEM высокий уровень глюкозы в | Invitrogen | 11965-118 | |
| DMEM низкий уровень глюкозы | Invitrogen | 11885-092 | |
| Фетальной телячьей сыворотки (FBS) | Invitrogen | 10091-148 | |
| Фактор роста снижается 3-D Cultrex базальной мембраны Извлечение | Trevigen ООО | Концентрация белка между 14-15mg/ml | |
| D2.0R и D2A1 клеточных линий | 5,19 | ||
| K7M2 и K7M2AS1.46 клетки | 20 | ||
| MCF-7 и MDA-MB-231 клеток рака молочной железы | АТСС | ||
| 8 камеры стекло системе | (Лаборатория-ТЭК, Thermo Scientific) | 177402 | |
| Сотовые Титр 96 Водные одно решение пролиферации клеток анализа комплект | Promega | G3580 | |
| VECTASHIELD монтажа среде с DAPI | Векторные Laboratories, Inc | H-1200 | |
| Нормальная осла сыворотке | Джексон ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Elisa ридер | Bio-Tec | Запись 490nm | |
| Конфокальной микроскопии | Цейсс-LSM-510 | Увеличение x63 |
Ссылки
- Aguirre-Ghiso, J. A. Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy. Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).
- Pantel, K., Woelfle, U. Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors. J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).
- Naumov, G. N. Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases. Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).
- Klein, C. A. Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations. Curr Opin Genet Dev. , (2010).
- Naumov, G. N. Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy. Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).
- Townson, J. L., Chambers, A. F. Dormancy of solitary metastatic cells. Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Pantel, K. Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells. J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).
- Demicheli, R. Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer. Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).
- Braun, S. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).
- Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. Cancer micrometastases. Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).
- Goss, P. E., Chambers, A. F. Does tumour dormancy offer a therapeutic target. Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).
- Mendoza, A. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).
- Naumov, G. N. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).
- Barkan, D. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
- Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth. Eur J Cancer. , (2010).
- Barkan, D. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Morris, V. L. Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth. Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
